穩(wěn)定表達(dá)牛γ干擾素細(xì)胞系的建立與鑒定.pdf

1、牛γ干擾素(BoIFN-γ)是特異性抗原或有絲分裂原刺激機(jī)體后,主要由CD4+Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞等所分泌表達(dá)的一種細(xì)胞因子,具有廣譜抗病毒、抑制細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能。IFN-γ可以作為免疫佐劑,增強(qiáng)疫苗的免疫效果。機(jī)體IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài),而抗原特異性的IFN-γ反應(yīng)則可以作為機(jī)體針對(duì)某種特定外來(lái)抗原的細(xì)胞免疫狀態(tài)的指標(biāo)。因此,制備針對(duì)BoIFN-γ特異性單抗,并以此

2、建立抗原特異性的BoIFN-γ免疫學(xué)檢測(cè)方法,可以進(jìn)行牛結(jié)核等感染性疾病的診斷。本研究應(yīng)用Flp-In-293細(xì)胞成功構(gòu)建了可以穩(wěn)定表達(dá)BoIFN-γ的細(xì)胞系。同時(shí),應(yīng)用特異性單克隆抗體建立了檢測(cè)評(píng)價(jià)BoIFN-γ的夾心ELISA方法。
　　 從重組質(zhì)粒pVAX1-preBoIFN-γ中擴(kuò)增出preBoIFN-γ片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCR2.1-preBoIFN-γ并進(jìn)行測(cè)序;將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒使用Kpn I和Xba I雙酶切后

3、,將酶切片段連接至表達(dá)載體pcDNA3.1-FLAG,構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pcDNAB.1-preBoIFN-γ-FLAG;然后使用Xba I和Apa I雙酶切,將酶切片段連接克隆至表達(dá)載體pcDNA5/FRT并進(jìn)行測(cè)序,構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG。
　　 將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-preBoIFN-γ-FLAG瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞,孵育48小時(shí)后,間接免疫熒光鑒定結(jié)果顯示BoIFN-γ在C

4、OS-1細(xì)胞中得到成功表達(dá);采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將重組質(zhì)粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG與重組酶表達(dá)載體pOG44共轉(zhuǎn)染Flp-In-293細(xì)胞,孵育48小時(shí)后,用含120μg/ml Hygromycin B的完全培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選,3-4周后挑取克隆擴(kuò)大培養(yǎng),并進(jìn)行亞克隆,使用ELISA、胞內(nèi)染色、免疫印跡等方法進(jìn)行鑒定,將陽(yáng)性克隆細(xì)胞系命名為B1。結(jié)果顯示,BoIFN-γ得到成功表達(dá),并且主要以分泌形式表達(dá)到細(xì)胞

5、上清中,β-半乳糖苷酶活性及Zeocin抗性分析表明,經(jīng)過(guò)有限稀釋法純化后獲得的細(xì)胞克隆,不再具有l(wèi)acZ-Zeo融合蛋白活性,目的蛋白可以穩(wěn)定表達(dá)。
　　 通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-γ)和BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析純化得到重組蛋白His-BoIFN-γ和GST-BoIFN-γ;以一定量的P3代重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,感染后96h

6、左右,待細(xì)胞病變明顯時(shí)收集上清,對(duì)上清進(jìn)行處理后得到Bac-BoIFN-γ;牛尾靜脈無(wú)菌采集肝素鈉抗凝血,加入適量美洲商陸(PWM)后,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱刺激培養(yǎng)24h,收集上清獲得天然BoIFN-γ。
　　 使用微量細(xì)胞病變抑制法,通過(guò)MDBK/VSV細(xì)胞系統(tǒng)分別測(cè)定重組蛋白His-BoIFN-γ、GST-BoIFN-γ、Bac-BoIFN-γ、FLAG-BoIFN-γ和天然BoIFN-γ的抗病毒活性,結(jié)果顯示其抗病毒效價(jià)分

7、別達(dá)到8.389×107 U/mg、6.554×105 U/mg、4.069×104 U/ml、1.024×104 U/ml和1.28×103U/ml,具有較高抗病毒活性牛γ干擾素的獲得為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了重要的生物材料。
　　 抗病毒分析方法(Antiviral assay,AVA)是第一個(gè)建立起來(lái)的檢測(cè)干擾素樣品相對(duì)活性或效能的生物學(xué)方法,現(xiàn)有的干擾素生物學(xué)活性鑒定方法普遍存在費(fèi)時(shí)、繁瑣、不夠精確、特異性差等一系列缺陷,亟待改