TRAF3及其剪接體TRAF3-S調控鴨的抗病毒天然免疫反應的分子機制研究.pdf

1、腫瘤壞死因子受體相關因子3（TNF receptor associated factor3，TRAF3）作為連接上下游信號轉導的一個中轉分子，在細胞內具有多樣化的功能。已有研究表明TRAF3負調控MAPK信號通路和非經典的NF-κB信號通路，但是正調控I型干擾素信號通路。I型干擾素的產生依賴于細胞表面或細胞內的病原模式識別受體（PRRs）對病原相關分子模式（PAMPs）的識別。其中Toll樣蛋白受體(TLRs)和RIG-I樣解旋酶受體(

2、RLRs)是最主要的兩類模式識別受體。TRAF3在TLRs介導的和RLRs介導的I型干擾素信號通路中發(fā)揮著重要的作用。在TLRs介導的I型干擾素信號通路中，TRAF3通過與上游信號分子TRIF相互作用（TLR3和TLR4），將激活信號傳遞給下游信號分子激活I型干擾素的產生；在RLRs介導的I型干擾素信號通路中，TRAF3與上游信號蛋白MAVS相互作用，將激活信號傳遞給下游信號分子誘導I型干擾素產生。TRAF3在哺乳動物天然免疫反應中扮演

3、的重要角色已經被研究的比較清楚，而鴨TRAF3在鴨天然免疫信號通路中是否也具有同樣重要的功能，目前未見有報導。
　　在本研究中，我們克隆鑒定得到鴨的全長TRAF3基因（duTRAF3）及其可變剪接體（duTRAF3-S），利用qRT-PCR分析duTRAF3和duTRAF3-S在健康鴨組織及Poly（I：C）刺激條件下的表達變化。我們的研究工作發(fā)現(xiàn)duTRAF3正調控IFN-β信號通路，而duTRAF3-S負調控IFN-β信號通路

4、，并且對duTRAF3和duTRAF3-S調控IFN-β信號通路的機制進行了詳細的研究，發(fā)現(xiàn)了剪接體蛋白調節(jié)信號通路的一種新機制，即duTRAF3-S可以通過與野生型duTRAF3相互作用，改變野生型duTRAF3同源三聚體的結構，從而負調控IFN-β信號通路。主要研究內容如下：
　　1.duTRAF3促進IFN-β產生，duTRAF3-S抑制IFN-β產生
　　首先克隆獲得野生型 duTRAF3基因的cDNA序列及其剪接體

5、duTRAF3-S的cDNA序列，提交GenBank，并構建了它們的表達載體。在Poly（I：C）處理的動物實驗中，利用qRT-PCR檢測了duTRAF3、duTRAF3-S和IFN-β基因的轉錄水平變化，發(fā)現(xiàn)duTRAF3可能上調IFN-β的表達，而duTRAF3-S可能下調IFN-β的表達。通過雙熒光報告基因實驗和VSV-GFP檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)過表達duTRAF3確實正調控IFN-β的產生，而過表達duTRAF3-S抑制IFN-β的產

6、生。
　　2.duTRAF3與duMAVS和duTRIF相互作用，而duTRAF3-S則不能
　　免疫共沉淀實驗表明, duTRAF3通過TRAF結構域與duMAVS或duTRIF相互作用，分別激活RLRs介導的或TLRs介導的IFN-β信號通路；而duTRAF3-S不能與duMVAS或duTRIF相互作用，說明剪接體duTRAF3-S與duTRAF3比較，存在功能障礙。
　　3.duTRAF3-S的N末端與C末端發(fā)生

7、折疊
　　duTRAF3-S含有TRAF結構域，卻不能與duMAVS或duTRIF相互作用，我們猜測duTRAF3-S的N末端將C末端的TRAF結構域包裹。通過熒光素酶片段互補實驗證明了duTRAF3-S的N末端與C末端發(fā)生分子內相互作用，即duTRAF3-S的兩端發(fā)生折疊。
　　4.duTRAF3-S抑制duTRAF3-duMAVS/duTRIF復合物形成
　　我們通過構建不同的duTRAF3截短體，并通過免疫共沉淀

8、實驗證明coil3結構域是duTRAF3形成聚合物必需的，并且duTRAF3形成同源聚合物對于duTRAF3與duMAVS和duTRIF的相互作用至關重要。duTRAF3-S含有coil3結構域，通過免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)duTRAF3-S能夠與duTRAF3相互作用，形成異源聚合物，抑制duTRAF3同源聚合物的形成，從而抑制duTRAF3-duMAVS/duTRIF復合物形成，最終使IFN-β產生受到抑制。
　　5.duTRAF

9、3抑制H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復制，duTRAF3-S促進H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復制
　　通過在 DEFs細胞中過表達 duTRAF3或 duTRAF3-S后感染H5N1/HM病毒或DTMUV病毒，發(fā)現(xiàn)duTRAF3抑制H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復制，而duTRAF3-S促進H5N1/HM病毒和DTMUV病毒復制，與duTRAF3正調控IFN-β信號通路和duTRAF3-S負調控IFN-β信號通路是一