MicroRNA-223、白介素27對巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 MicroRNA-223對巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答調(diào)控的機(jī)制研究
　　天然免疫是機(jī)體抵抗病毒入侵的第一道有效防線，當(dāng)機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞將通過模式識別受體識別病毒成分并活化下游的信號通路，從而表達(dá)Ⅰ型干擾素和促炎癥細(xì)胞因子。其中Ⅰ型干擾素在激發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并且其表達(dá)受到機(jī)體的精確調(diào)控。MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的長

2、度約為21～23個(gè)堿基的非編碼寡聚核苷酸，其功能主要是通過與mRNA的3'非編碼區(qū)(3'UTR)特異靶位點(diǎn)相互作用從而負(fù)向調(diào)控mRNA的翻譯。miRNA參與調(diào)控了多種生物學(xué)過程，包括生長、發(fā)育、分化、腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等。此外，miRNA在調(diào)控天然免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，病毒在miRNA層面與機(jī)體的相互作用和機(jī)制目前受廣泛關(guān)注。已有多篇關(guān)于miRNA參與調(diào)控抗病毒天然免疫應(yīng)答的相關(guān)報(bào)道，如miRNA-146a和miRNA-155分別在抗病

3、毒天然免疫應(yīng)答中起著負(fù)向和正向的調(diào)控作用。因此，我們想通過探求在病毒感染過程中胞內(nèi)表達(dá)改變的miRNA并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，為抗病毒感染提供新的潛在靶點(diǎn)。
　　我們先期通過查閱文獻(xiàn)篩選出了一些在髓系細(xì)胞中高表達(dá)的miRNAs（包括miR-21,miR-25,miR-34a,miR-106a,miR-125b,miR-146a和miR-223），并通過熒光定量PCR(Q-PCR)檢測了這些miRNAs在RNA病毒VSV感染小鼠腹腔

4、巨噬細(xì)胞的過程中表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)miR-223的表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，VSV并不是通過自身RNA和蛋白的合成來誘導(dǎo)miR-223的上調(diào)，而是通過誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生來促進(jìn)miR-223的上調(diào)的，如果阻斷Ⅰ型干擾素下游信號通路后再用VSV刺激，miR-223的表達(dá)將不再上調(diào)。之后，我們將合成的siRNA轉(zhuǎn)染到小鼠巨噬細(xì)胞中，來模擬內(nèi)源性miR-223的功能或特異性抑制其作用來進(jìn)一步研究miR-223的功能，并通過Q-PCR、噬

5、菌斑定量實(shí)驗(yàn)、TCID50定量實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測了miR-223對RNA病毒感染的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細(xì)胞中過表達(dá)miR-223能夠上調(diào)Ⅰ型干擾素，抵抗RNA病毒的感染;抑制miR-223后會下調(diào)Ⅰ型干擾素，促進(jìn)RNA病毒的感染。在分子機(jī)制研究中，我們檢測了過表達(dá)miR-223對RNA病毒活化的下游信號通路關(guān)鍵分子的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-223并沒有明顯增強(qiáng)p38、ERK、JNK和IκBα的磷酸化，并且對RIG-Ⅰ的表達(dá)

6、、IRF3的磷酸化以及PKR的磷酸化也沒有顯著影響，但是能夠促進(jìn)IRF7的表達(dá)。相反，如果抑制miR-223，IRF7的表達(dá)也相應(yīng)地降低了。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)OXO3能夠抑制IRF7的轉(zhuǎn)錄活性，所以我們推測miR-223可能是通過靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子forkhead box O3(FOXO3)來促進(jìn)miR-223的表達(dá)的，通過miRNA靶點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)FOXO3確實(shí)是miR-223的一個(gè)新的靶點(diǎn)。最后，我們分別通過

7、干擾和過表達(dá)FOXO3進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-223確實(shí)是通過靶向抑制FOXO3，增強(qiáng)IRF7的轉(zhuǎn)錄活性，從而上調(diào)Ⅰ型干擾素發(fā)揮抗病毒作用。
　　綜上所述，RNA病毒感染能夠在小鼠巨噬細(xì)胞中通過促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生誘導(dǎo)miR-223表達(dá)的上調(diào)，誘導(dǎo)上調(diào)的miR-223又可以通過靶向抑制FOXO3的表達(dá)，增強(qiáng)IRF7的轉(zhuǎn)錄活性，從而上調(diào)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生來發(fā)揮抗病毒作用。該研究結(jié)果為巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答的調(diào)控機(jī)制增添了新的認(rèn)識，并可

8、能為抗病毒免疫治療提供新的思路。
　　第二部分 白細(xì)胞介素27對巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答調(diào)控的機(jī)制研究
　　Interleukin27(IL-27)是IL-12細(xì)胞因子家族中的一員，它是一種異二聚體的細(xì)胞因子，由EBI3和p28兩個(gè)亞基組成。IL-27的受體也是一個(gè)異源二聚體，它是由一條配體結(jié)合鏈IL-27Rα(WSX-1，TCCR)和另一條信號傳導(dǎo)鏈gp130組成。IL-27通過IL-27Rα/gp130傳遞信號，活化下

9、游分子JAK和STAT1/STAT3。活化的STAT1/STAT3能夠調(diào)控下游不同T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的活性，例如T-bet(Th1)，GATA-3(Th2) and ROR-γt(Th17)等。此外，IL-27受體信號還能夠活化MAPK招募并活化下游的轉(zhuǎn)錄因子c-Maf和AP1來影響細(xì)胞的增殖和分化。近些年來，越來越多的證據(jù)表明IL-27在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。與多數(shù)的細(xì)胞因子類似，IL-27在炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮了兩面性的作用

10、，既能促進(jìn)炎癥的發(fā)生，也能抑制炎癥的發(fā)生。而目前有關(guān)IL-27功能的研究主要集中在IL-27對T細(xì)胞分化和功能的影響這方面，關(guān)于其在抗病毒天然免疫應(yīng)答中的作用研究十分有限。因此，本次研究旨在揭示IL-27在巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答調(diào)控中發(fā)揮的重要作用。
　　我們發(fā)現(xiàn)，RNA病毒VSV感染巨噬細(xì)胞的過程中，巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-27亞單位mRNA表達(dá)顯著增加。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)用重組的小鼠IL-27(rmIL-27)預(yù)處理小鼠巨噬細(xì)胞能夠明顯

11、抑制VSV的復(fù)制，但是對巨噬細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)無顯著影響，表明IL-27可能是通過不依賴Ⅰ型干擾素的方式發(fā)揮抗病毒作用。同時(shí)我們還觀察到用rmIL-27預(yù)處理小鼠巨噬細(xì)胞能夠抵抗H1N1和HSV的感染。接著我們又在小鼠體內(nèi)進(jìn)一步研究了IL-27的抗病毒效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)IL-27受體亞基IL-27Rα敲除（IL-27Rα-/-）小鼠相對于同窩對照的野生型(WT)小鼠腹腔對VSV和H1N1的感染更加敏感，同時(shí)我們也觀察到IL-27受體亞基IL

12、-27Rα敲除對于VSV感染后小鼠血清中的IFN-β的水平無顯著影響。在分子機(jī)制的研究中，我們通過基因芯片發(fā)現(xiàn)rmIL-27處理能夠明顯上調(diào)interferon gamma inducible protein47(Ifi47)和interferon inducible GTPase1(Iigp1)的表達(dá)，于是我們進(jìn)一步研究了Ifi47和Iigp1在IL-27調(diào)控機(jī)體抗病毒天然免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮的作用，發(fā)現(xiàn)IL-27確實(shí)是通過上調(diào)Ifi4

13、7和Iigp1發(fā)揮抗病毒作用。同時(shí)我們初步探究了IL-27上調(diào)Ifi47和Iigp1的具體機(jī)制，發(fā)現(xiàn)JNK的抑制劑能夠明顯抑制IL-27誘導(dǎo)的Ifi47和Iigp1的上調(diào)，表明IL-27可能是通過JNK信號通路依賴的方式來上調(diào)Ifi47和Iigp1。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)病毒感染能夠誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-27，而巨噬細(xì)胞自分泌的IL-27或者外源添加的重組IL-27細(xì)胞因子可能通過與巨噬細(xì)胞表面的IL-27受體結(jié)合后活化下游