褐飛虱細(xì)胞色素P450兩個(gè)新基因CYP4C61和CYP6CW1的克隆及表達(dá)研究.pdf

1、水稻是主要的糧食作物之一,而褐飛虱(Nilaparvata lugens St(a)l.)卻是水稻的頭號(hào)害蟲,取食引起的物理傷害及形成的唾液鞘會(huì)影響水稻韌皮部的傳導(dǎo)功能,進(jìn)而擾亂根系的生理活動(dòng),并加速葉片衰老。其發(fā)生與危害嚴(yán)重影響稻谷的產(chǎn)量。褐飛虱的遷飛習(xí)性增加了監(jiān)測與控制褐飛虱發(fā)生的難度,使得褐飛虱給水稻生產(chǎn)造成巨大損失的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。雖然目前科學(xué)家已成功培育出各種抗性水稻新品種,但褐飛虱能很快適應(yīng)水稻新品種,往往導(dǎo)致抗性水稻品種的推

2、廣和應(yīng)用受到制約。昆蟲的CYP4家族的P450常被報(bào)道代謝內(nèi)源性物質(zhì)如激素和脂肪酸等,而CYP6家族的P450受植物次生物質(zhì)和殺蟲劑的誘導(dǎo),并參與相應(yīng)底物的代謝。為深入研究褐飛虱細(xì)胞色素P450的功能,我們開展了有關(guān)褐飛虱細(xì)胞色素P450的克隆及表達(dá)的研究工作,現(xiàn)總結(jié)如下:
　　 采用簡并RT-PCR技術(shù)與RACE技術(shù)相結(jié)合,克隆了褐飛虱細(xì)胞色素P450基因CYP4C61和CYP6CW1 cDNA全長。CYP4C61基因的cDN

3、A全長為2581 bp,含有一個(gè)編碼503個(gè)氨基酸殘基的開放閱讀框(open reading frame,ORF)。在cDNA全長序列的3'端有31個(gè)脫氧腺苷酸組成的polyA尾巴,在polyA的上游有1個(gè)加尾信號(hào)序列AATAAA;該cDNA的5'端非翻譯區(qū)(5'untranslational region,5'UTR)長度為184bp,3'UTR長度為888 bp。該cDNA編碼的蛋白質(zhì)序列被命名為CYP4C61,該cDNA全長序列已

4、被登錄到EMBL數(shù)據(jù)庫(GenBank accession number:FM163384);CYP6CW1基因全長為2063bp,含有一個(gè)編碼539個(gè)氨基酸殘基的開放閱讀框ORF。在cDNA全長序列的3'端有30個(gè)脫氧腺苷酸組成的polyA尾巴,在polyA的上游有1個(gè)加尾信號(hào)序列AATAAA;該cDNA的5'端非翻譯區(qū)5'UTR長度為199 bp,3'UTR長度為109 bp。該cDNA編碼的蛋白質(zhì)序列被命名為CYP6CW1,該cD

5、NA已被登錄到EMBL數(shù)據(jù)庫(FN421126)。對(duì)CYP4C61和CYP6CW1的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),它們都含有昆蟲P450基因的保守特征序列,如螺旋K(E-R-P),氧結(jié)合結(jié)構(gòu)域即螺旋I(AG-T),血紅素結(jié)合區(qū)(PF-G-C-G-F)等。CYP4C61和CYP6CW1氨基酸殘基內(nèi)部都具有潛在的磷酸化位點(diǎn),這些位點(diǎn)的磷酸化可能對(duì)該酶行使正常功能所必需;另外CYP4C61和CYP6CW1的N端都存在跨膜螺旋,長度分別為25 aa和21

6、 aa。這些特點(diǎn)與P450的降解和代謝功能是密切相關(guān)的。
　　 通過GenBank中同源性查找表明,CYP4C61與褐飛虱的另一個(gè)P450 CYP4C62的同源性最高,達(dá)55％;其次與蜚蠊Blaberus discoidalis的CYP4C1(登錄號(hào)P29981)的同源性較高,達(dá)54％。CYP4C61,CYP4C62,CYP4C1,CYP4C3和CYP4C39在進(jìn)化樹中形成一個(gè)獨(dú)立的簇。CYP6CW1與CYP6BK17的同源性最

7、高,達(dá)36％;其次與CYP6CE2的同源性達(dá)35％。CYP6CW1,CYP6AX1,CYP6AY1和CYP6BK17在進(jìn)化樹中形成一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化枝。
　　 通過體外轉(zhuǎn)錄獲得CYP4C61和CYP6CW1的正反義鏈RNA探針,對(duì)褐飛虱腸道組織進(jìn)行整體原位雜交檢測。結(jié)果顯示CYP4C61在整個(gè)中腸組織不表達(dá)。而CYP6CW1在取食感蟲水稻臺(tái)中1號(hào)(TN1)的褐飛虱腸道組織有本底水平的表達(dá),而在取食中度抗蟲水稻的褐飛虱腸道組織中有高水

8、平表達(dá),推測其產(chǎn)物可能參與代謝抗性水稻的有毒次生物質(zhì)。
　　 以B-actin為參照基因,采用半定量PCR技術(shù)檢測了褐飛虱CYP6CW1、CYP4C61在褐飛虱體壁、脂肪體、中腸組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明,CYP6CW1主要在中腸組織中表達(dá),而CYP4C61則主要在脂肪體中表達(dá),由此進(jìn)一步推斷CYP6CW1可能參與了水稻次生物質(zhì)的代謝,而CYP4C61可能參與內(nèi)源性物質(zhì)的代謝。本研究為深入了解P450基因在褐飛虱的生長發(fā)育及適