蚯蚓細胞色素P450基因的克隆及CYP1A2的蛋白表達特征研究.pdf

1、蚯蚓是土壤中生物量最大的動物類群之一，具有重要的生態(tài)功能。同時蚯蚓對于土壤中污染物的降解具有重要作用，是土壤生態(tài)毒理研究的重要指示生物。細胞色素P450酶是一類在生物體中廣泛存在的代謝酶系，又稱為多功能氧化酶、藥物代謝酶或單加氧酶等。由于P450酶具有種類多樣性和底物特異性的特點，使得這類酶能夠催化多種類型的反應。細胞色素P450酶不僅參與一些內源物質的代謝，如激素、脂肪酸等，還在許多外源物質如環(huán)境污染物的代謝中起著重要作用。
　

2、　目前關于蚯蚓生態(tài)毒理的研究主要集中于利用蚯蚓作為指示生物對土壤環(huán)境進行監(jiān)測和評價，常見的可用于環(huán)境監(jiān)測和評價的蚯蚓體內的生物標志物主要有金屬硫蛋白、抗氧化酶、體腔細胞結構與DNA損傷等。對于蚯蚓體內的P450基因克隆和蛋白表達方面的研究很少。
　　本文通過設計引物，采用RT-PCR和RACE-PCR的技術成功從蚯蚓中提取出一條細胞色素P450基因，并對其分類地位上相似的動物P450進行進化上的比對和蛋白表達分析。然后以赤子愛勝蚓

3、、多肉遠盲蚓和威廉腔蚓為試驗材料，提取這三種蚯蚓的整體組織蛋白，以及赤子愛勝蚓不同器官和不同成長階段的組織蛋白進行提取，測定蛋白濃度，采用Western-blot免疫印跡方法檢測分析了細胞色素P450酶系中的亞酶CYP1A2的蛋白表達情況。
　　實驗結果表明，通過使用特異性引物成功的從蚯蚓體內克隆出一條編碼P450的基因（命名為EW1）。該序列總長1004bp，編碼區(qū)全長492bp，編碼163個氨基酸，提交至 GenBank所得序

4、列號：ID:KM881474。該序列含有典型的細胞色素P450保守區(qū)域，包括：血紅素結合區(qū)域FXXGXXXCXG，P450蛋白活性位點螺旋I；位于螺旋C中與血紅素結合有關的序列W xxx R，能夠與亞鐵功能區(qū)域的自由基發(fā)生作用；包含在螺旋K內的序列E xx R，是所有P450蛋白內最容易識別的序列。
　　從GenBank數據庫中選取了來自10個物種的P450基因序列，結合蚯蚓的P450基因序列，利用MEGA5.0獲得了進化樹。對進

5、化樹進行分析表明，蚯蚓的P450序列 EW1與渦蟲（Schmidtea mediterranea）P450的同緣關系最近，其次是曼氏血吸蟲（Opisthorchis felineus）和日本血吸蟲（Schistosoma japonicum）的P450基因，同緣關系最遠的是文蛤蜊（Meretrix meretrix）。
　　應用蛋白模擬軟件Phyre2對克隆到的蚯蚓P450進行同源模建，以數據庫中已提交的三維結構為模板，得到蚯蚓P

6、450序列的三維結構模型，發(fā)現與其同源性最高的為CYP45027家族，其中與人的CYP27B家族同源性最高，三維結構相似度高達97％，對比人的CYP27B的活性中心，在結構的相應位置找到了蚯蚓P450的活性中心。
　　CYP1A2蛋白表達研究結果表明不同發(fā)育時期的赤子愛勝蚓的CYP1A2蛋白表達量有顯著差異（P<0.05）。其中在成體蚯蚓中的表達最高，其次是亞成體，在蚯蚓幼體中的表達最低。CYP1A2蛋白在赤子愛勝蚓的不同器官中的

7、表達也有顯著差異（P<0.05）。通過數據分析可知，在腸中的表達最高，顯著高于受精囊和體壁（P<0.05），而在受精囊和體壁中有表達但是二者差異不顯著（P＞0.05）。另外，在赤子愛勝蚓、威廉腔蚓和多肉遠盲蚓三種不同種類蚯蚓中CYP1A2蛋白的表達有一定差異但差異不顯著（P＞0.05）。
　　本論文首次克隆出了一條蚯蚓的細胞色素P450基因，同時首次鑒定出CYP1A2在蚯蚓體內的表達情況。這些結果對于進一步研究蚯蚓對污染物的代謝與