水稻紋枯病菌菌核形成過程中特異基因的表達與分析.pdf

1、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)是一類十分重要的植物病原真菌,寄主范圍廣泛,可引起包括水稻、小麥、玉米等重要作物在內(nèi)的多種作物菌核病的發(fā)生,危害十分嚴重。而關(guān)于水稻紋枯病致病病原菌菌核的形成和發(fā)育機理,目前國內(nèi)外研究已經(jīng)有較多報道,但主要集中于營養(yǎng)和環(huán)境因子等對菌核形成的影響,而在菌核形成的分子生物學研究方面,盡管有了一些有益的探索,但至今仍缺乏深入的研究。許多與立枯絲核菌菌核形成的相關(guān)基因有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。

2、　　 本項目采用抑制消減雜交方法(Suppression Subtractive Hybridization,以下簡稱SSH)結(jié)合虛擬Northern篩選方法(virtual Northern)構(gòu)建了水稻紋枯病菌菌核形成過程誘導表達產(chǎn)生的差減cDNA文庫,分離并克隆出菌核形成相關(guān)基因,從基因轉(zhuǎn)錄表達水平探討菌核形成機理,以期為水稻紋枯病防治提供理論基礎(chǔ)。項目以GD-118菌株菌絲形成期材料mRNA為驅(qū)動子(driver),以菌核形成期

3、mRNA為檢測子(Tester),分別提取材料總RNA,分離mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,經(jīng)Rsa-I酶切,連接不同接頭后進行連續(xù)兩次消減雜交和兩次PCR反應以獲得差異表達基因片段。將PCR產(chǎn)物與T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞,通過藍白斑篩選獲得重組克隆,構(gòu)建紋枯病原菌菌核特異性表達cDNA文庫。從庫中隨機篩選145個白色菌落經(jīng)PCR鑒定其中有112個克隆有目的基因片段插入,且插入片段大小主要分布在200-500bp之間。挑取

4、陽性克隆進行測序,所得序列利用DNAMAN軟件去除載體及接頭序列,剔除重復序列,獲得部分差異表達ESTs。對所獲得的ESTs繼續(xù)應用Virtual Northem雜交篩選,以菌絲、菌核cDNA序列為探針進行驗證。將經(jīng)過驗證差異表達明顯的序列做進一步同源性比對并分析相關(guān)序列的表達結(jié)果,獲得了菌核形成相關(guān)的28條特異表達基因片段,其中有16條序列在GeneBank上較高同源性序列,主要涉及脅迫響應、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號傳導、合成代謝等,其中另有1