cDNA-AFLP分析與白葉枯病菌互作中水稻基因的表達圖譜.pdf

1、本文以日本晴水稻(Nipponbare)成熟種子誘導獲得的愈傷組織，轉至MS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得水稻懸浮培養(yǎng)系。用親合的白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)JxoI接種水稻懸浮細胞進行互作，互作不同時間的水稻細胞，用液氮冷凍，研磨后熱酚抽提，氯化鋰沉淀提取總RNA，并進一步使用鏈霉素結合的oligo(dT)-磁珠法分離純化mRNA，純化的mRNA以oligo(dT)21引物反轉錄出cDNA第一鏈，繼而合成c

2、DNA第二鏈。 得到的雙鏈全長cDNA先后用限制性內切酶VspI(識別4個堿基位點)和TaqI(識別6個堿基位點)酶切，酶切后的cDNA片段帶有兩種粘性末端，分別連接上與之對應的兩種接頭，得到代表水稻細胞轉錄圖譜且?guī)в薪宇^的cDNA片段池(pool)。使用與接頭序列互補的寡核苷酸引物(oligo63/oligo43)對cDNA片段池進行PCR擴增，使cDNA片段池中不同豐度的基因片段都達到一定的濃度。對擴增后的cDNA池定量至1

3、ng/ul，作選擇性擴增的模板。共使用64對引物組合進行選擇性擴增。其中與TaqI粘末端相對應的選擇性引物用[γ-32p]ATP進行末端標記。選擇性擴增產物在含有7.5M尿素的5％的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳后的凝膠用X光片顯示出不同處理水稻細胞的基因轉錄圖譜。根據X光片所顯示信息，對凝膠上差異擴增片段進行回收。64對選擇性引物擴增中共得到384個有差異的擴增片段，其中321個受白葉枯病菌誘導后上調表達，余下的63個下調表達。

4、 差異表達的基因片段回收后，對其中的100個片段作測序分析，測序結果在GenBank里在線分析，其中23個功能已知或有可能功能，41個功能未知。 根據測序結果，選擇6個差異表達的基因用實時定量PCR(real-timequantitativePCR)驗證。驗證結果與cDNA-AFLP中所顯示這6個基因表達變化情況相符合，表明cDNA-AFLP中回收的DNA差異表達片段的確代表水稻細胞與白葉枯病菌互作后差異表達的基因。