蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞凋亡的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、蓖麻毒素是蓖麻籽中存在的一種能使核糖體失活的高效蛋白質(zhì)，并由A、B鏈構(gòu)成，A鏈?zhǔn)蔷哂蠳-糖苷酶活性的活性鏈，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到抑制，引發(fā)細(xì)胞死亡;B鏈具有凝集素活性，能夠識(shí)別和結(jié)合細(xì)胞表面含有半乳糖結(jié)構(gòu)的受體，協(xié)助A鏈進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)一個(gè)蓖麻毒素分子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)時(shí)，就可以使整個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成停止最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段，用蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)人十二指腸腺癌細(xì)胞(HuTu-80)，分析全蛋白差異表達(dá)的情況，為蓖麻毒蛋

2、白在HuTu-80細(xì)胞中的作用機(jī)理提供新的試驗(yàn)窗口。
　　 1.本研究首先采用硫酸銨鹽析法，從蓖麻種籽中提粗素，通過(guò)Sepharose4B柱親和層析和SephacrylS-200柱凝膠過(guò)濾層析對(duì)其進(jìn)行純化，經(jīng)β-巰基乙醇處理，可見(jiàn)A鏈分子量為28KDa，B鏈的分子量為32KDa的蓖麻毒素。SDS-PAGE鑒定純化后的蓖麻毒素達(dá)到了電泳純。測(cè)定其濃度后，用獲得的蓖麻毒蛋白對(duì)HuTu-80細(xì)胞進(jìn)行IC50試驗(yàn)。結(jié)果表明:細(xì)胞形態(tài)發(fā)生

3、變化，而IC50為200ng/ml。
　　 2.構(gòu)建蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞的凋亡模型，通過(guò)MTT排除試驗(yàn)、AO/EB染色、AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡，確定蓖麻毒蛋白誘導(dǎo)HuTu-80細(xì)胞早期凋亡時(shí)相，提取細(xì)胞組分蛋白進(jìn)行Western-blot分析，觀察HuTu-80細(xì)胞在凋亡過(guò)程中細(xì)胞色素c的遷移情況。結(jié)果表明:蓖麻毒蛋白對(duì)HuTu-80細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，IC50為200ng/m

4、l，最佳攻毒時(shí)間為8h，同時(shí)HuTu-80細(xì)胞的形態(tài)特征與生物化學(xué)特征也發(fā)生了一系列的變化，細(xì)胞核出現(xiàn)皺縮和破裂的情況，釋放出致密顆粒狀凋亡小體，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸出現(xiàn)外翻，而細(xì)胞色素c隨著蓖麻毒蛋白處理時(shí)間的增加，從線粒體易位到細(xì)胞漿逐漸顯著。
　　 3.用蓖麻毒蛋白濃度為200ng/ml，時(shí)間為8h處理細(xì)胞，分別提取正常組和處理組的HuTu-80細(xì)胞全蛋白，iTRAQ同位素標(biāo)記技術(shù)與質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)得到1660個(gè)蛋白信息，其