豬2型鏈球菌免疫蛋白質(zhì)組學(xué)與比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S．suis）屬于球菌科、鏈球菌屬，是世界范圍內(nèi)致豬鏈球菌病最主要的病原。該菌可分為35個(gè)血清型，其中豬2型鏈球菌(SS2)致病性強(qiáng)、流行廣，該型亦是臨床分離頻率最高的血清型。SS2可引起豬腦膜炎以及敗血癥等疫病，人通過(guò)特定的傳播途徑亦可感染該菌，是一種重要的人畜共患病病原。1991年黃毓茂首次報(bào)道在廣東省發(fā)現(xiàn)豬2型鏈球菌病疑似病例，1998-1999年江蘇省部分地區(qū)連續(xù)2年在盛夏季節(jié)暴發(fā)

2、該病，不但造成大量豬死亡，而且有數(shù)十人感染致死。2005年在四川資陽(yáng)及周邊地區(qū)發(fā)生的豬2型鏈球菌病，引起204人感染發(fā)病，導(dǎo)致38人死亡。全球因豬2型鏈球菌感染已引起300多人死亡。盡管豬鏈球菌作為嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)和危及人類健康的傳染病病原，但其致病機(jī)理和免疫機(jī)理研究卻相對(duì)滯后。雖然滅活疫苗可以對(duì)同型細(xì)菌提供保護(hù)力，但對(duì)其他血清型卻缺乏保護(hù)力。疫苗的抗原成分不清制約著新型疫苗的開發(fā)。因此我們使用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)開展從SS2細(xì)胞壁相

3、關(guān)蛋白中鑒定免疫原性蛋白的研究，并進(jìn)行了從SS2細(xì)胞壁免疫原性蛋白中篩選保護(hù)性抗原的研究，力圖為新型疫苗和診斷試劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。與此同時(shí)，我們應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)SS2感染前后宿主血清蛋白質(zhì)的變化開展了研究，以期發(fā)現(xiàn)SS2感染的標(biāo)志物和/或研究SS2的致病機(jī)理?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果報(bào)告如下：
　　 1．SS2細(xì)胞壁相關(guān)蛋白的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 利用雙向電泳將提取的豬2型鏈球菌細(xì)胞壁相關(guān)蛋白進(jìn)行分離，并同時(shí)使用滅活疫苗

4、免疫血清、人工感染康復(fù)期血清、臨床感染康復(fù)期血清以及陰性對(duì)照血清與2-D分離的細(xì)胞壁相關(guān)蛋白進(jìn)行Western Blot，篩選免疫原性蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。本研究共從細(xì)胞壁相關(guān)蛋白中鑒定了34個(gè)免疫原性蛋白，其中15個(gè)蛋白可以為所有的免疫血清和康復(fù)血清所識(shí)別，包括目前報(bào)道的疫苗候選抗原溶菌酶釋放蛋白(MRP)、表面蛋白1(SAO)和重要的粘附蛋白：3-磷酸甘油醛脫氫酶(GapdH)。其他相關(guān)研究所鑒定的免疫原性蛋白淀粉酶結(jié)合蛋白Bamy

5、lase-binding protein B(AbpB)，內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶l(Endothelin-convertingenzyme1)和核酸酶（putative5’-nucleotidase）也在本研究中成功篩選鑒定，說(shuō)明本研究結(jié)果可靠。15個(gè)蛋白中有9個(gè)蛋白的免疫原性在本研究中首次被發(fā)現(xiàn)。另外，SecA、自溶酶（autolysin）、次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶(ImpdH)和高親和力的鋅攝取系統(tǒng)znuA前體蛋白(znuA)只為康復(fù)血清所識(shí)別

6、而不為免疫血清所識(shí)別，通過(guò)熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)菌，感染豬腦部細(xì)菌的autolysin,ZnuA，ImpdH，和SecA的mRNA均出現(xiàn)了125士38，85±45，10士4和9387±1366倍的增長(zhǎng)。表明這些基因在體內(nèi)（至少在感染豬的腦部）誘導(dǎo)表達(dá)。本研究篩選鑒定的免疫原性蛋白無(wú)疑為闡明疫苗抗原成分具有重要意義，也為新型疫苗和診斷試劑的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2．SS2新型保護(hù)性抗原的研究
　　 克

7、隆所篩選的29個(gè)豬2型鏈球菌細(xì)胞壁免疫原性蛋白，并重組表達(dá)純化。Western Blot驗(yàn)證重組蛋白的免疫反應(yīng)性。將純化的重組蛋白與弗氏佐劑乳化后制備疫苗分別免疫小鼠，使用低劑量(5LD50)和高劑量(20LD50)的SS2攻毒檢測(cè)重組蛋白的免疫保護(hù)效果。研究發(fā)現(xiàn)，在使用低劑量攻毒時(shí)大部分蛋白免疫的小鼠都可以保護(hù)，但使用高劑量攻毒時(shí)能提供較高保護(hù)力的只有HP0197、HP1036和Enolase。ELISA試驗(yàn)證實(shí)這些蛋白均可以誘導(dǎo)高水

8、平的抗體，主要為Th2型免疫應(yīng)答。Real-time PCR表明相對(duì)于體外培養(yǎng)的細(xì)菌，感染豬腦部細(xì)菌的mRNA均上調(diào)表達(dá)，并且鑒定的保護(hù)性抗原均可與Hep-2細(xì)胞的表面粘附，表明這些蛋白可能參與了細(xì)菌的致病過(guò)程。本研究成功從豬2型鏈球菌細(xì)胞壁免疫原性蛋白中篩選到保護(hù)性抗原，為新型疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　 3．SS2感染后血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究
　　 血漿/血清蛋白質(zhì)由于其組成中包含了來(lái)源于細(xì)胞、組織、器官的蛋白信息，研

9、究疾病與健康狀態(tài)下血漿蛋白質(zhì)的差異，將極大促進(jìn)疾病的早期診斷與治療監(jiān)測(cè)等方面的進(jìn)步，也有利于闡明疾病的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的治療方法，發(fā)現(xiàn)有效疫苗及新的藥物靶標(biāo)。本研究通過(guò)血清比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法比較SS2感染前后血清中蛋白質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)最具生物學(xué)意義的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜分析，共鑒定了其中5個(gè)點(diǎn)（4個(gè)蛋白），分別為上調(diào)表達(dá)的α1-抗胰蛋白酶、血清珠蛋白、補(bǔ)體C4，以及下調(diào)表達(dá)的載脂蛋白AI。本研究提示了對(duì)這些血清蛋白的研究將促