致豬水腫病大腸桿菌Stx2e基因缺失株的構建及其相關功能性分析.pdf

1、豬水腫病是常發(fā)于斷奶后仔豬的一種具有致命性的腸毒血癥，其病原為某些特定血清型的產(chǎn)志賀樣毒素大腸桿菌，一經(jīng)發(fā)病，病死率極高，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，直接引發(fā)豬水腫病發(fā)生的元兇是致病大腸桿菌產(chǎn)生的一種蛋白類毒素Stx2e。致病菌通過F18ab菌毛粘附豬腸上皮細胞后，產(chǎn)生并釋放Stx2e毒素，通過腸壁吸收入血，造成特定組織損傷，從而導致水腫病的發(fā)生。由于病原血清型復雜，滅活疫苗的預防效果并不理想。除此之外，某些

2、致豬水腫病大腸桿菌并不產(chǎn)生單一Stx2e毒素，亦可產(chǎn)生其他的腸毒素（最常見的是STa、STb），也給本病的預防帶來較大困難。經(jīng)檢測，致豬水腫病大腸桿菌1522標準株以及1525株不含有除Stx2e毒素基因以外的其他常見毒素基因，故此本研究選取該菌作為研究對象，成功構建Stx2e毒素基因缺失株，為進一步深入研究Stx2e毒素與機體相互作用的分子機制，水腫病致病機理及對國內豬大腸桿菌病的防控策略奠定了一定基礎。
　　 λ-Red同源

3、重組系統(tǒng)被廣泛的應用于某些革蘭氏陰性菌基因組的特定基因的修飾，是對基因進行功能分析的有效手段。該方法可以對目的基因的任何位點進行插入、刪除或者是用外源DNA序列進行替換，而并不涉及到使用限制性內切酶、DNA連接酶，大大的簡化了操作。本實驗中應用該系統(tǒng)修飾和缺失大腸桿菌目的基因的過程可簡述如下:基于Stx2e基因的已知序列，首先將能夠編碼Red同源重組酶的輔助質粒轉化至野生株中，制備感受態(tài)細胞。設計合成一對5'端與Stx2e基因同源，3'

4、端與氯霉素抗性基因同源的引物擴增氯霉素抗性基因，然后將純化的產(chǎn)物轉化野生型大腸桿菌，該細胞中已提前導入含有誘導型啟動子的質粒pKD46，利用該質粒編碼的λ噬菌體的Red同源重組系統(tǒng)構建其基因缺失突變株，篩選陽性菌株，并將pCP20質粒導入重組菌，利用其編碼的Flp重組酶消除氯霉素標記，得到所要的Stx2e基因缺失株，并通過PCR檢驗和測序手段加以驗證。Vero細胞毒性實驗進一步在細胞水平證明了Stx2e毒素基因的缺失。
　　 在

5、1522△Stx2e成功構建的基礎上，比較分析了野生株和突變株相關生物學特性的變化。體外生長實驗和酵解實驗表明，同樣的培養(yǎng)條件下，1522△Stx2e株生長速度及生長周期各個階段的特性與野生株相比沒有差異，其分解發(fā)酵糖類和氨基酸的能力也未發(fā)生改變。但是細菌粘附實驗表明，相較野生株，Stx2e基因缺失株細菌粘附豬腸上皮細胞IPEC-J2的能力大幅度降低，可達30％。最后，我們將K99菌毛基因通過pMD18-T載體克隆入1522△Stx2e