豬源腸外致病性大腸桿菌六型分泌系統(tǒng)PPECC33_00229基因缺失株的構(gòu)建及功能研究.pdf

1、自Ⅵ型分泌系統(tǒng)(T6SS)2006年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，這十年間它一直作為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的一個(gè)研究熱點(diǎn)，而關(guān)于腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)的T6SS的研究卻并不多。T6SS是一種在效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的動(dòng)態(tài)裝置，它保守地存在于25％的革蘭氏陰性菌中，其中包括銅綠假單胞菌、霍亂弧菌及大腸桿菌等。T6SS還可分泌效應(yīng)分子靶向競(jìng)爭(zhēng)細(xì)菌及真核細(xì)胞，因此其在細(xì)菌的致病性中起重要作用。PCN033屬豬源腸外致病性大腸桿菌，它分離于2006年高熱病病

2、豬腦部，是一株高致病性菌株。通過(guò)對(duì)其全基因組測(cè)序及進(jìn)一步的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了T6SS基因簇的存在。本研究中以PCN033作為研究對(duì)象，探究其T6SS簇內(nèi)基因PPECC33_00229（以下簡(jiǎn)稱0229）的功能。即構(gòu)建以PCN033為親本菌株的△0229基因缺失株，通過(guò)比較其與親本菌株的生物學(xué)特性，探究基因0229的功能。
　　1.△0229基因缺失株及△0229-0229互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
　　采用的是自殺性質(zhì)粒pRE112介導(dǎo)的

3、同源重組的方法，首先擴(kuò)增0229的上下游同源臂。分別將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到穿梭質(zhì)粒pBluescriptⅡ SK(+)上，酶切回收連接好的同源臂，轉(zhuǎn)而連接至pRE112上構(gòu)建重組質(zhì)粒。成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入x7213中，并以其為供體菌，PCN033為受體菌，進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。經(jīng)過(guò)兩次單交換過(guò)程，利用蔗糖敏感性及氯霉素抗性，對(duì)菌株進(jìn)行正反篩選，進(jìn)而得到△0229基因缺失株。通過(guò)所設(shè)計(jì)的基因外部及內(nèi)部的鑒定引物，PCR擴(kuò)增鑒定，最終確定△0229基因

4、缺失株的構(gòu)建成功。
　　擴(kuò)增0229基因產(chǎn)物，酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其連入穿梭質(zhì)粒pHSG396，成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到△0229缺失株，氯霉素抗性平板篩選陽(yáng)性克隆子，并通過(guò)設(shè)計(jì)的通用引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，成功獲得△0229-0229互補(bǔ)菌株。
　　2.細(xì)菌間競(jìng)爭(zhēng)能力相關(guān)性的研究
　　以大腸桿菌的K12菌株W3110作為被捕食菌，野生株P(guān)CN033，缺失株△0229作為捕食菌株，進(jìn)行種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)作用，結(jié)果顯示，與缺失株△022

5、9互作的試驗(yàn)組中，W3110的存活率有明顯下降，也就是在基因0229缺失后，菌株的競(jìng)爭(zhēng)能力增強(qiáng)。表明基因0229可能在細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)中起到一定作用。
　　3.致病力相關(guān)性的研究
　　小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)作為細(xì)胞模型，進(jìn)行的吞噬后存活試驗(yàn)，分別比較野生株P(guān)CN033及缺失株△0229被細(xì)胞吞噬后，在各時(shí)間點(diǎn)的存活率，缺失株在2h、4h后相比野生株的存活能力雖有上升，但差異并不具有顯著性，而6h后的結(jié)果差異明顯。而

6、在以人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)為細(xì)胞模型的粘附侵入試驗(yàn)中，相比于野生株P(guān)CN033，缺失株△0229試驗(yàn)組的粘附侵入能力顯著上升，且互補(bǔ)菌株△0229-0229對(duì)這種表型的差異有明顯的回補(bǔ)效果，結(jié)果表明0229可能與PCN033粘附侵入HBMEC，引起腦膜炎相關(guān)。
　　以4周齡的雌性昆明鼠作為動(dòng)物模型，比較野生株P(guān)CN033與缺失株△0229的組織定殖能力。摘取小鼠的腦、脾、肺及腎組織，并對(duì)其中的細(xì)菌量進(jìn)行計(jì)數(shù)，缺失株△02

7、29試驗(yàn)組在各組織中的菌量顯著高于野生株P(guān)CN033試驗(yàn)組，表明缺失株△0229具有更強(qiáng)的組織定殖能力。利用菌株P(guān)CN033的本體動(dòng)物豬的全血，進(jìn)行全血?dú)⒕囼?yàn)，比較野生株及缺失株在與全血互作1h、2h、3h后的存活率，結(jié)果顯示，相對(duì)于野生株，缺失株在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的存活率更高，但經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析，該差異不具有顯著性。
　　4.熒光定量PCR對(duì)T6SS相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)
　　熒光定量PCR檢測(cè)野生株P(guān)CN033及缺失株△02