豬圓環(huán)病毒2型與細胞自噬的相互作用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcinecircovirustype2，PCV2)可以引起豬的免疫功能抑制和持續(xù)性感染，其引起的豬圓環(huán)病毒相關疾病(PCVAD)是危害當今全球養(yǎng)豬生產的最重要的病毒性傳染病之一，目前關于PCV2的致病機制仍然不清楚，因此深入探究PCV2致病機理十分必要。細胞自噬(Autophagy)在病原體感染過程中發(fā)揮著重要作用，與病毒的清除和逃避有關。本論文擬揭示PCV2感染誘導宿主細胞自噬的現(xiàn)象，分析細胞自噬在PCV2復制中

2、的作用，旨在從一個新視角為深入研究PCV2的致病機理奠定基礎。
　　 用PCV2SD/2008株感染或經(jīng)紫外線滅活后刺激PK-15細胞，運用透射電鏡和激光共聚焦免疫熒光技術，分別檢測細胞中的自噬囊泡和自噬體標志物LC3分子以及自噬降解底物p62蛋白的表達情況。結果顯示，PCV2活毒及滅活后均能誘導PK-15細胞產生大量的雙層膜和單層膜的自噬體樣囊泡，顯著提高自噬體標志分子LC3的表達量，降低自噬底物p62的表達量。進而用PCV2

3、SD/2008株感染5w健康巴馬香豬，感染后3、7、28d，在豬的淋巴結中的巨噬細胞和肝細胞胞漿內可見大量自噬囊泡，在肺泡巨噬細胞以及淋巴結、脾臟、腎臟等組織細胞內可檢測到自噬體標志物LC3分子表達。上述體外和體內實驗結果表明，PCV2可以誘導宿主細胞自噬的發(fā)生。
　　 為了明確自噬對PCV2復制的影響，在PCV2感染PK-15細胞之前或之后分別應用自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3

4、-MA)人工改變宿主細胞的自噬活性，然后應用透射電鏡、激光共聚焦免疫熒光、Real-timePCR及IPMA等技術檢測細胞自噬囊泡、自噬標志分子或PCV2核酸含量，分析自噬對PCV2復制的影響。結果顯示，利用Rapa誘導細胞自噬可顯著提高PK-15細胞內PCV2核酸含量(P＜0.01)以及病毒滴度(P＜0.01)。表明細胞自噬可促進PCV2在PK-15細胞中的復制。
　　 為了進一步驗證細胞自噬對PCV2在感染動物內復制的影響，

5、本研究首先應用Rapa和3-MA建立了自噬誘導和自噬抑制的小鼠模型，然后將100只8周齡雄性BALB/c小鼠隨機分為4組，分別為PCV2感染自噬誘導(PCV2+Rapa)組、PCV2感染自噬抑制(PCV2+3-MA)組、病毒(PCV2)感染組和空白對照(PBS)組，每組25只。于感染后3、7、14、21、28和56d，每組隨機剖殺4只小鼠，取肝臟或脾臟檢測自噬現(xiàn)象與PCV2載量。結果顯示，感染后7、14d在自噬誘導小鼠的脾臟和肝臟混合物

6、內沒有檢測到PCV2核酸，而于感染后21、28d顯著高于自噬抑制組和PCV2單獨感染組的含量(P＜0.01);自噬誘導小鼠肝臟、脾臟等組織中的病毒蛋白信號數(shù)量的變化趨勢與自噬體標志分子LC3和Beclin信號數(shù)量的趨勢基本一致。上述實驗結果表明，細胞自噬參與了PCV2的感染過程，并對病毒在宿主細胞內的復制及持續(xù)感染產生影響。
　　 綜上所述，本研究證明PCV2感染可誘導細胞自噬，而細胞自噬對PCV2的體外復制有促進作用，自噬有利