草莓鑲脈病毒編碼蛋白對(duì)其啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用及其亞啟動(dòng)子鑒定.pdf

1、草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus,SVBV)屬于花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)花椰菜花葉病毒屬(Caulimovirus),SVBV為環(huán)狀雙鏈DNA病毒,基因組結(jié)構(gòu)與花椰菜花葉病毒(CaMV)相似,包含7個(gè)ORF,也含有2個(gè)啟動(dòng)子。SVBV全長(zhǎng)啟動(dòng)子P1位于ORFVI基因下游,與CaMV35S啟動(dòng)子的位置相同,驅(qū)動(dòng)ORFI、ORFII、ORFIII、ORFIV和ORFV基因的轉(zhuǎn)錄;OR

2、FVI基因的轉(zhuǎn)錄由一個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子sP驅(qū)動(dòng),類(lèi)似于CaMV的19S啟動(dòng)子。本研究進(jìn)一步分析了SVBV2個(gè)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性、驅(qū)動(dòng)外源基因在植物中的表達(dá)模式以及驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性。另外,本研究還分析了SVBVORFI、ORFII、ORFIII、ORFIV和ORFV基因編碼的蛋白對(duì)全長(zhǎng)啟動(dòng)子P1的調(diào)節(jié)作用。
　　1.SVBV各啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因瞬間表達(dá)的組織化學(xué)染色
　　將pINTP1、pINTP2、pINTP3、pINT

3、P4、pINTP5和pINT121各表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌分別注射本氏煙莖桿,組織化學(xué)染色并制備石蠟切片。顯微觀察發(fā)現(xiàn),維管組織和部分皮層組織均能觀察到藍(lán)色位點(diǎn),說(shuō)明各啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)gus基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。
　　2.SVBV各啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gfp基因的瞬間表達(dá)和熒光活性觀察
　　將SVBVP1、SVBVP2、SVBVP3、SVBVP4和SVBVP5各啟動(dòng)子分別與載體pCHF3gfp基因前的35S啟動(dòng)子置換,獲得植物表達(dá)載體

4、pCHFP1、pCHFP2、pCHFP3、pCHFP4和pCHFP5,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,菌液分別注射本氏煙莖桿,制備莖桿注射區(qū)徒手切片。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),各植株維管組織均能觀察到綠色熒光,說(shuō)明各啟動(dòng)子均能驅(qū)動(dòng)gfp基因在植物細(xì)胞中表達(dá)。從各切片的綠色熒光強(qiáng)度上來(lái)看,pCHFP1中g(shù)fp基因的表達(dá)水平要高于陽(yáng)性對(duì)照pCHF3。注射未轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌菌液,莖桿切片中幾乎觀察不到綠色熒光。
　　3.轉(zhuǎn)基因普通煙gus基因mRNA的Rea

5、l-timePCR檢測(cè)
　　Real-timePCR檢測(cè)pINTP1和pINT121轉(zhuǎn)基因普通煙gus基因的mRNA積累量,結(jié)果表明,pINTP1和pINT121轉(zhuǎn)基因普通煙gus基因的mRNA積累量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因普通煙,pINTP1轉(zhuǎn)基因普通煙gus基因的mRNA積累量顯著高于pINT121轉(zhuǎn)基因普通煙,說(shuō)明SVBVP1啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性很高,且超出35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性。
　　4.SVBV各ORF表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)全

6、長(zhǎng)啟動(dòng)子P1調(diào)節(jié)作用
　　構(gòu)建SVBV中國(guó)分離物各ORF植物表達(dá)載體pBIN-ORFI、pBIN-ORFII、pBIN-ORFIII、pBIN-ORFIV、pBIN-ORFV和pBIN-ORFVI,電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,將含有各表達(dá)載體的農(nóng)桿菌分別和含有表達(dá)載體pINTP1的農(nóng)桿菌等量混合,瞬間浸潤(rùn)本氏煙葉片,熒光光度法定量分析gus表達(dá)活性,結(jié)果顯示pBIN-ORFII和pBIN-ORFV分別與pINTP1共浸潤(rùn)時(shí)gus蛋白酶活性均顯

7、著高于pINTP1單獨(dú)浸潤(rùn),pBIN-ORFIV與pINTP1共浸潤(rùn)時(shí)gus蛋白酶活性顯著低于pINTP1單獨(dú)浸潤(rùn),pBIN-ORFI、pBIN-ORFIII、pBIN-ORFVI分別與pINTP1共浸潤(rùn)時(shí)gus蛋白酶活性與pINTP1單獨(dú)浸潤(rùn)均無(wú)顯著差異。結(jié)果表明,ORFII和ORFORFV編碼蛋白均能提高P1啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)活性,ORFI、ORFIII、ORFVI編碼蛋白對(duì)P1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)活性沒(méi)有影響,ORFIV編碼蛋白降低P1啟動(dòng)子的驅(qū)