豬傳染性胃腸炎病毒TH-98株N基因在大腸桿菌中的表達及重組N蛋白的純化.pdf

1、該論文首次在中國對豬傳染性胃腸炎病毒核衣殼蛋白基因進行了克隆、鑒定、表達及重組核蛋白的純化;并在細胞上對重組核衣殼蛋白抗體的中和效力進行了測定.主要結(jié)果如下:以豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)TH-98強毒株基因組mRNA為模版,根據(jù)文獻已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒核蛋白(N)基因cDNA序列及載體pProEXHTb的多克隆酶切位點序列,設(shè)計和合成一對引物,以RT-PCR技術(shù),擴增其N基因;將RT-PCR產(chǎn)物按正確的閱讀框架(ORF)定向克

2、隆到載體pProEXHTb上,重組質(zhì)粒PHN轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH<,5α>株,通過酶切分析及序列測定表明獲得了TGEV N基因的無性繁殖系.經(jīng)DNAStar軟件進行序列分析表明:TH-98強毒株的N基因與參考毒株P(guān)urdue-115株、FS772/70株、T014株、96-1933株及TFI株的核苷酸序列的同源性分別為99﹪、97﹪、97﹪、95﹪、96﹪;氨基酸序列的同源性分別為99﹪、97﹪、98﹪、96﹪、97﹪,因此TGEV N基因

3、具有高度的保守性.根據(jù)載體pProEXHTb含有(His)<,6>特點,將融合蛋白進行純化,在純化過程中經(jīng)各項條件的探索,確定為在裂解液中含有1mM PMSF的條件下,分別經(jīng)過2倍體積的buffer A和buffer B洗脫后,再收集PH5.9,含有80mmol/L咪唑的1倍體積buffer C洗脫液,可得到純化的融合蛋白.將純化的融合蛋白免疫家兔,制備的抗血清在豬IBRS<,2>傳代細胞上進行中和實驗,結(jié)果顯示中和效價為1:22,表明