豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其基因組測序分析.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV），屬于尼多病毒目冠狀病毒科Alpha病毒亞群，是一種具有囊膜結構的單股正鏈RNA病毒，可以在豬的小腸上皮黏膜細胞胞漿中進行復制，臨床上可以引起豬傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)。目前各豬場對TGE的防治均以免疫接種為主，但由于TGEV作為RNA病毒具有高突變、高重組的特點

2、，使得現階段使用的TGEV疫苗難以對豬群起到較好的免疫保護作用。因此對當前臨床流行的TGEV分離鑒定及其生物學特性研究是研制新型高效疫苗的基礎。
　　本文對從齊齊哈爾市某豬場獲得的疑似感染TGEV病豬剖檢后的小腸病料進行無菌處理后，在豬睪丸細胞(ST)上進行盲傳培養(yǎng)鑒定，觀察到典型的特征性細胞病變(CPE)。根據RT-PCR和間接免疫熒光實驗證實成功分離了兩株TGEV流行毒株，將其分別命名為HE-1和HE-4。電子顯微鏡觀察病毒形

3、態(tài)，在胞漿中可以看到具有典型冠狀病毒形態(tài)特點的病毒粒子。
　　根據GenBank數據庫中報道的TGEV-HX序列，設計包含TGEV全基因組序列的13對交叉引物對TGEV HE-1、HE-4分離株結構蛋白和非結構蛋白基因進行擴增;利用RACE試劑盒，對病毒基因組非編碼區(qū)5'UTR和3'UTR通過RT-PCR技術得到了相應序列;對測序獲得的結果進行序列拼接獲得病毒的全基因組序列。生物信息學分析結果顯示:TGEV分離株HE-1、HE-4

4、與國內外目前報道的已上傳全基因組序列基因信息的TGEV病毒分離株具有較高的同源性，與國內分離株AYU、HX、WH-1和國外分離株Purdue P115同源關系最高，達到99.8％，與變異株PRCV-ISU-1同源性最低為97.4％。建立了基于TGEV全基因組和不同單個基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，其中TGEV全基因組進化樹結果顯示:分離株HE-1和HE-4都和TGEV Purdue群而不是與TGEV Miller群保持更近的親緣關系。TGEV各

5、毒株的不同基因進化樹的進化分支情況也有所差異，這可能是與不同基因在進化過程中的保守性和變異情況有關。TGEV分離株HE-1、HE-4全基因組均由28580個核苷酸組成，具有典型冠狀病毒TGEV基因序列特征;5'和3'非編碼區(qū)相對保守，在非結構基因ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF3b、ORF7未發(fā)生插入和缺失;在分別負責編碼結構蛋白如膜結合蛋白(M)、核蛋白(N)和小膜蛋白(E)的基因上雖無插入和缺失現象發(fā)生，但是其分別有4、2