20512.腸桿菌(enterobactersp.cn1)甲酸代謝及相關(guān)產(chǎn)氫基因的研究

1、分類號分類號碩士學(xué)位論文腸桿菌（Enterobactersp.CN1）甲酸代謝及相關(guān)產(chǎn)氫基因的研究StudyonfmicacidmetabolismrelatedgenesofhydrogenproductioninEnterobactersp.CN1姓名邱玉鋒學(xué)號10908050所在學(xué)院理學(xué)院導(dǎo)師姓名胡忠專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)入學(xué)日期2009年9月答辯日期2012年6月汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文：腸桿菌（Enterobactersp.CN

2、1）甲酸代謝及相關(guān)產(chǎn)氫基因的研究I摘要?dú)錃庥捎谄涓咝?、清潔、無污染而被認(rèn)為是未來最具潛力的能源；生物制氫與其他制氫方法相比，只需在常溫常壓下進(jìn)行且底物利用范圍廣，故具有良好的發(fā)展前景。然而，目前已有菌種及其發(fā)酵工藝條件優(yōu)化后的產(chǎn)氫量仍未能到達(dá)工業(yè)化生產(chǎn)的要求，所以應(yīng)用分子生物學(xué)的手段對菌種及其代謝途徑的改造就顯得非常有必要。發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的產(chǎn)氫過程包括以下三種途徑：丙酮酸脫羧產(chǎn)氫途徑、通過甲酸裂解產(chǎn)氫途徑、通過輔酶I(NADH)的氧化還原

3、平衡調(diào)節(jié)作用產(chǎn)氫。氫酶是一類在微生物體內(nèi)催化放氫與吸氫的酶，在生物發(fā)酵制氫中發(fā)揮重要作用。本文以木糖高效產(chǎn)氫菌Enterobactersp.CN1為研究對象，通過其甲酸代謝產(chǎn)氫、甲酸對木糖產(chǎn)氫的影響、次亞磷酸鈉（HPP）對不同碳源產(chǎn)氫的抑制作用；以及甲酸鹽代謝途徑中甲酸氫裂解酶激活子基因（fhlA）和NiFe氫酶基因(hycEhycG)的克隆、表達(dá)以及重組菌株的產(chǎn)氫分析，初步闡述了Enterobactersp.CN1木糖產(chǎn)氫代謝中的甲酸

4、鹽途徑。主要的研究結(jié)果如下：以0、10、15、20mM的甲酸為單一碳源，在pH6和pH7下發(fā)酵產(chǎn)氫，發(fā)現(xiàn)生成氫氣的量幾乎等于甲酸的量，而且隨著甲酸濃度的增加，菌體濃度有所下降。同時添加10gL的木糖作為碳源，發(fā)現(xiàn)pH7下的產(chǎn)氫量均高于pH6下的產(chǎn)氫量，并且隨著甲酸濃度的增加，pH6和pH7下的產(chǎn)氫量均有增加且增加量大于甲酸的量；而菌體濃度也隨著甲酸濃度的增加有所增加。進(jìn)一步的酶抑制劑實(shí)驗(yàn)表明，HPP能完全抑制除甲酸外其他碳源的產(chǎn)氫。表明

5、，甲酸在Enterobactersp.CN1木糖產(chǎn)氫代謝中具有重要的作用，推測Enterobactersp.CN1木糖產(chǎn)氫代謝途徑中可能具有甲酸鹽途徑。為進(jìn)一步驗(yàn)證Enterobactersp.CN1中甲酸鹽代謝途徑的存在，利用簡并引物克隆分別獲得了fhlA基因和NiFe氫酶基因的部分片段，并通過重新設(shè)計引物獲得了兩個基因的全長開放閱讀框。fhlA基因的全長開放閱讀框含有2058bp堿基對，編碼一個含685個氨基酸的多肽，其預(yù)測分子量大

6、小約為77kD，pI為5.80，與其他產(chǎn)氫菌的該基因具有高度的同源性。NiFe氫酶具有大小亞基，大亞基基因（hycE）全長開放閱讀框含有1710bp堿基對，編碼一個含569個氨基酸的蛋白亞基，預(yù)測其大小約為64.89kD，pI為6.24。而小亞基基因(hycG)的全長開放閱讀框含有768bp堿基對，編碼一個含255個氨基酸的蛋白亞基，預(yù)測其大小約為28.03kD，pI為7.24，這與其他一些菌屬的NiFe氫酶蛋白特征非常相似。進(jìn)一步的氨