基于氫酶-3的產(chǎn)氫代謝調(diào)控及NADH產(chǎn)氫途徑機制初探.pdf

1、隨著當(dāng)前化石能源危機以及其引發(fā)的全球氣候變化和環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，對清潔環(huán)保的綠色能源開發(fā)與探索顯得更為迫切。氫能作為一種能量密度大、可再生、清潔環(huán)保的綠色可替代能源受到廣泛關(guān)注。在諸多產(chǎn)氫技術(shù)中，厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)器設(shè)計簡單及可利用廉價有機廢物制備等特點，使其成為氫能源和環(huán)保領(lǐng)域研究熱點。但厭氧發(fā)酵較低的產(chǎn)氫效率一直是技術(shù)瓶頸，嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。因此，厭氧發(fā)酵制氫對高效產(chǎn)氫菌的選育尤為重要，成為當(dāng)前厭氧發(fā)酵制氫工

2、業(yè)化的研究重點，目前利用基因工程和輔酶工程等新技術(shù)選育高效產(chǎn)氫工程菌成為研究熱點方向之一。
　　本研究以產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes CCTCC AB91102為出發(fā)菌株，該菌株具有易于培養(yǎng)、底物適用范圍廣和發(fā)酵周期短等諸多優(yōu)點，使之成為具有工業(yè)化潛力的產(chǎn)氫菌種之一。產(chǎn)氣腸桿菌厭氧發(fā)酵是一個相對復(fù)雜的代謝過程，對其產(chǎn)氫代謝的研究包括甲酸裂解途徑和NADH途徑。通過甲酸裂解途徑的氫酶基因的同源表達，增加氫酶

3、的表達量，從而達到提高工程菌產(chǎn)氫效率的目的。此外，還對其發(fā)酵條件做了優(yōu)化，以進一步提高產(chǎn)氫量。同時，針對產(chǎn)氣腸桿菌另一產(chǎn)氫途徑（NADH途徑）展開了代謝機理初步探索。主要研究內(nèi)容和結(jié)果摘要如下：
　　1.構(gòu)建了過表達氫酶-3亞基的同源重組工程菌 AB91102-hycE和AB91102-hycG。以產(chǎn)氣腸桿菌E. aerogenes AB91102基因組DNA為模板，擴增得到氫酶-3大亞基（HycE）hycE基因（GenBank

4、No. KM096473）、膜結(jié)合蛋白（HycF） hycF基因（GenBank No. KM096474）以及小亞基（HycG）hycG基因（GenBank No. KM096475）。針對hycE和hycG兩個基因成功構(gòu)建了表達質(zhì)粒 pET28a-Pkan-hycE和 pET28a-Pkan-hycG，并將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入產(chǎn)氣腸桿菌 AB91102中，獲得AB91102-hycE和AB91102-hycG兩株高效工程菌?；蚬こ叹a(chǎn)氫特

5、性研究結(jié)果顯示，工程菌產(chǎn)氫效率較原始菌株分別提高11.51％和6.77%。發(fā)酵液成分及產(chǎn)氫貢獻分析表明：基因工程菌甲酸裂解途徑的產(chǎn)氫量分別提高了5.4%和1.9%，NADH途徑的產(chǎn)氫量分別提高了54.8%和40.6%。該結(jié)果表明氫酶-3亞基過表達不僅可提高甲酸裂解途徑產(chǎn)氫，而且可促進NADH途徑產(chǎn)氫。
　　2.優(yōu)化工程菌E. aerogenes AB91102-hycE厭氧發(fā)酵條件。首先，采用單因素優(yōu)化了影響發(fā)酵的關(guān)鍵參數(shù)接種量、

6、溫度和初始pH，結(jié)果表明：最適接種量為10%，最適溫度為35℃，最適初始pH為6.0。在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上，進一步運用Central Composite Design（CCD）設(shè)計實驗，利用統(tǒng)計學(xué)軟件SAS9.0分析和預(yù)測響應(yīng)值。預(yù)測最優(yōu)發(fā)酵條件：接種量為11.6%，溫度為34.6℃，初始pH值為6.07。厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫驗證實驗得到的實際產(chǎn)氫效率為1.175 mol H2/mol葡萄糖，與模型預(yù)測值1.169 mol H2/mol葡萄糖非常

7、接近，表明預(yù)測模型的可靠性。
　　3.考察了產(chǎn)氣腸桿菌氫酶-3的HycE、HycF和HycG亞基功能。利用Red重組系統(tǒng)完成抗性標(biāo)記基因與氫酶-3基因進行同源重組，從產(chǎn)氣腸桿菌基因組成功分別敲除了hycE、hycF和 hycG基因，并消除抗性基因，獲得突變菌株分別命名為AB91102-ΔhycE、AB91102-ΔhycF和AB91102-ΔhycG。厭氧恒化實驗結(jié)果表明，突變菌株總NAD（H）濃度變化不大，但NADH/NAD+比