昆蟲(chóng)病原真菌金龜子綠僵菌中性海藻糖酶在孢子儲(chǔ)藏穩(wěn)定性中的作用.pdf

1、蝗蟲(chóng)是世界性的害蟲(chóng)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。金龜子綠僵菌是一種蝗蟲(chóng)病原真菌，在蝗蟲(chóng)生物防治中起著重要作用。目前，世界上已經(jīng)有十多個(gè)金龜子綠僵菌菌株登記注冊(cè)，并實(shí)現(xiàn)了商品化，但這些產(chǎn)品常常不穩(wěn)定。阻礙綠僵菌殺蟲(chóng)劑大規(guī)模應(yīng)用的主要原因之一是孢子的儲(chǔ)藏和環(huán)境穩(wěn)定性問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室從我國(guó)蝗蟲(chóng)病原菌中分離、選育出一株高毒力、高產(chǎn)孢、強(qiáng)?；缘臍⒒刃戮杲瘕斪泳G僵菌CQMa102，用該綠僵菌生產(chǎn)的孢子粉及其油懸浮劑已在國(guó)內(nèi)登記注冊(cè)，正逐步實(shí)現(xiàn)

2、商品化，卻也同樣存在進(jìn)一步延長(zhǎng)儲(chǔ)藏期，增強(qiáng)環(huán)境穩(wěn)定性的問(wèn)題。 大量研究報(bào)道，海藻糖是廣泛存在于各種生物體內(nèi)的抗逆境劑，具有增強(qiáng)生物體對(duì)高溫、脫水、干旱、冷凍、高滲透性、重金屬及有毒試劑等逆境的抵抗能力。胞內(nèi)海藻糖積累與絲狀真菌孢子的儲(chǔ)藏期延長(zhǎng)密切相關(guān)。將釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)中性海藻糖酶基因敲除后，中性海藻糖酶活性喪失，海藻糖含量提高3倍。由此我們可以推測(cè)，通過(guò)基因工程技術(shù)改變綠僵菌體內(nèi)海藻糖代謝途徑，可以提高孢子內(nèi)海藻糖含量，延長(zhǎng)綠僵

3、菌孢子的儲(chǔ)藏期，增強(qiáng)其環(huán)境穩(wěn)定性，促進(jìn)其商品化生產(chǎn)和應(yīng)用。 要通過(guò)改變海藻糖代謝途徑來(lái)改良綠僵菌菌種，就必須了解綠僵菌體內(nèi)海藻糖的代謝和調(diào)控，但是人們對(duì)綠僵菌體內(nèi)海藻糖的代謝研究得較少，夏玉先等首先克隆了金龜子綠僵菌中性海藻糖酶基因，但其生物學(xué)功能還未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬通過(guò)增加金龜子綠僵菌中性海藻糖酶基因的拷貝數(shù)以減少孢子形成過(guò)程中海藻糖的合成，采用基因破壞技術(shù)去除或降低金龜子綠僵菌中性海藻糖酶活性以增加孢子中海藻糖含量，并進(jìn)一步

4、分析孢子中海藻糖的含量及其與孢子抗逆能力和耐儲(chǔ)藏能力的關(guān)系，從而闡明中性海藻糖酶在孢子耐熱力和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性中的作用。 本研究利用PCR、RT-PCR、RACE、panhandle PCR等方法成功地克隆了金龜子綠僵菌CQMa102中性海藻糖酶基因，并登錄NCBI 的GenBank，登錄號(hào)為：AY557613(基因組序列), AY557612(cDNA序列)。根據(jù)該基因序列構(gòu)建了金龜子綠僵菌中性海藻糖酶超表達(dá)載體、同源置換載體和RN

5、A干擾載體，分別利用PEG－CaCl2介導(dǎo)法、電轉(zhuǎn)化法和基因槍法，轉(zhuǎn)化金龜子綠僵菌CQMa102，經(jīng)過(guò)PCR篩選和Southern blot 驗(yàn)證，獲得3個(gè)中性海藻糖酶超表達(dá)轉(zhuǎn)化菌和3個(gè)RNAi轉(zhuǎn)化菌。利用Northern blot分析這幾個(gè)突變菌株中性海藻糖酶基因mRNA的含量，選擇中性海藻糖酶基因超表達(dá)2倍和中性海藻糖酶基因被抑制到42％的兩個(gè)轉(zhuǎn)化菌：Ma113和Ma688，將其與出發(fā)菌株進(jìn)行分生孢子內(nèi)海藻糖含量的測(cè)定，孢子儲(chǔ)藏特性

6、、孢子耐熱性以及生長(zhǎng)特性的比較，得出以下結(jié)論： ⑴金龜子綠僵菌分生孢子內(nèi)海藻糖含量隨著孢子成熟度的增加而迅速積累；出發(fā)菌株孢子內(nèi)海藻糖的積累速度比RNA干擾轉(zhuǎn)化菌的積累速度慢，而比超表達(dá)轉(zhuǎn)化菌的積累速度快。 ⑵在加速衰老儲(chǔ)藏過(guò)程中，成熟孢子比未成熟孢子耐貯；出發(fā)菌株孢子的耐貯性比RNA干擾轉(zhuǎn)化菌低，而比超表達(dá)轉(zhuǎn)化菌高。 ⑶在45℃條件下的熱激過(guò)程中，成熟孢子比未成熟孢子耐熱激；出發(fā)菌株孢子的耐熱性比RNA干擾轉(zhuǎn)

7、化菌低，而比超表達(dá)轉(zhuǎn)化菌高。 ⑷出發(fā)菌株、RNA干擾轉(zhuǎn)化菌和超表達(dá)轉(zhuǎn)化菌在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)孢率沒(méi)有明顯差異。 ⑸根據(jù)以上研究結(jié)果可以得出以下結(jié)論：金龜子綠僵菌中性海藻糖酶的生理功能是通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)海藻糖以控制胞內(nèi)海藻糖含量，從而間接影響孢子的耐貯性和耐熱激的能力，對(duì)孢子的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性有重要作用。 本研究成果可為采用發(fā)酵技術(shù)和包括基因工程在內(nèi)的育種技術(shù)提高蟲(chóng)生真菌分生孢子的儲(chǔ)藏和環(huán)境穩(wěn)定性提供新的理論依據(jù)和