金龜子綠僵菌致病相關基因Mmnt1和Mpt的克隆及功能分析.pdf

1、綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一類應用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲的生物防治中起著重要作用。綠僵菌侵染寄主的過程是個動態(tài)復雜的過程，但是目前僅初步闡明了金龜子綠僵菌通過分泌蛋白酶和幾丁質酶等水解酶穿透寄主表皮，以及真菌侵入昆蟲血腔后分泌酸性磷酸酶和海藻糖酶消耗宿主營養(yǎng)的機理。
　　 病原真菌致病的關鍵時期即侵入昆蟲血腔后到寄主死亡前的時期（侵入后），這一階段的研究還不是很清楚,但是這一階段對真菌致病又是相

2、當重要的。因此，本實驗室構建了金龜子綠僵菌在蝗蟲體內特異表達基因的差減文庫，在此基礎上，我們選擇了蝗蟲體內高表達的EST 序列，編號分別為GO004730和GO004735，長度分別為565 bp和456 bp。這兩個基因編碼的蛋白質分別同其他真菌中的異戊烯基轉移酶和α-1,2 甘露糖基轉移酶有很高的同源性，利用SMART技術分別獲取cDNA全長；利用定量PCR分析Mpt基因的表達譜，同時利用RNAi的方法研究了Mmnt1的功能。主要研

3、究結果如下：
　　 ①獲取了Mmnt1和Mpt基因的cDNA 全長，并進行了生物信息學分析。
　　 Mmnt1基因cDNA 全長1557bp，包括一個1296bp的開放閱讀框，125bp的5'UTR，136bp的3'UTR。cDNA 序列的Genbank 登錄號為GU990223。預測該基因編碼431個氨基酸。推測含有信號肽，其序列為MVAGNARYVRYIIIAVFTLAVFYFVSNSKY，其切割位點位于AVFVSN

4、S-KY 之間。Mpt基因cDNA 全長1194 bp，開放閱讀框為1026 bp，63 bp的5'UTR，105 bp的3'UTR。cDNA 序列的Genbank 登錄號為GU271134。預測該基因編碼341個氨基酸。推測信號肽序列為MAWFTGRFMAGEVAAILSAFALGYL，切割位點位于SAFALG-YL 之間②利用獲取的全長cDNA與綠僵菌基因組數(shù)據(jù)庫比對分析獲得Mmnt1和Mpt基因的DNA全長。
　　 將DN

5、A 序列與cDNA序列用bl2seq軟件比對，結果表明：Mmnt1基因的DNA全長1711 bp，含有兩個內含子（177bp-291bp）,(1469bp-1525bp)。Mpt基因的DNA全長1380bp，含有一個內含子（862bp-937bp）。分析內含子都具有典型的GT….AG邊界。
　　 ③定量PCR 分析Mpt基因在不同侵染時期的表達情況。
　　 定量PCR 檢測Mpt基因在不同侵染階段的表達量，結果表明該基因

6、在附著孢階段、侵染初期以及在1/4SDA培養(yǎng)基的條件下，表達量都很低，相對表達量分別為17.68％，17.70％和4.85％，而侵染后期及蟲體產孢時期與之相比，表達量明顯增加，相對表達量為81.23％和100％。
　　 ④利用RNAi的方法對Mmnt1基因的功能進行研究。干擾片段連接至RNA干擾載體（pbar-RNAi-gpd-trp）后，基因槍法轉化金龜子綠僵菌CQMa102，經過PCR 篩選,獲得5個Mmnt1基因的干擾突變

7、株，并用定量PCR的方法檢測干擾突變株中Mmnt1基因的表達量。結果表明，干擾突變株在不同侵染時期的干擾效率在40％-80％之間。
　　 ⑤對Mmnt1基因的干擾菌株進行了生物量的測定。干擾菌株和野生菌株分別接種至1/4SDA液體培養(yǎng)基及添加各種細胞壁破壞素的情況下，生物量結果分析表明，干擾菌株在添加KCl和H2O2的培養(yǎng)基上菌絲干重明顯低于野生型，而在添加剛果紅，熒光增白劑以及沒有添加其他物質的培養(yǎng)基上，干擾菌株菌絲干重與野生

8、型相比，差別不明顯。
　　 ⑥分析了Mmnt1基因干擾菌株在PDA培養(yǎng)基及添加各種細胞壁破壞素情況下的生長形態(tài)。干擾菌株和野生菌株的孢懸液分別接種于固體PDA培養(yǎng)上，觀察其菌落形態(tài)的差別。觀察結果表明，與野生型相比，干擾菌株在添加KCl和H2O2的PDA 培養(yǎng)基上生長明顯受到抑制，但在其他培養(yǎng)基上的生長狀況和野生型相差不大。這一結果，也和生物量測結果定相一致。
　　 ⑦對Mmnt1基因的干擾突變株孢子進行了了生物學毒力測