中藥生肌液-骨髓基質細胞-脫基質骨復合物修復兔橈骨缺損的研究.pdf

1、臨床上各種原因引起的骨缺損很常見，且治療困難。目前采用的自體骨和異體骨移植均有各自的不足之處：自體骨移植的骨量受到限制，另外也增加了病人的痛苦；而異體骨移植可能出現(xiàn)免疫排斥反應和其它的并發(fā)癥。1987年美國科學基金會提出組織工程概念，國內外組織工程研究取得令人注目的階段性研究成果，應用組織工程骨修復骨缺損將成為可能，將組織工程骨用于骨缺損的修復是臨床治療的趨勢所在。傳統(tǒng)外用中藥生肌膏對于感染性開放骨折療效顯著，將其有效成分優(yōu)化制備成生肌

2、液。本實驗旨在研究體內環(huán)境中生肌液對骨髓基質細胞(Marrow StromalCells，MSCs)增殖和分化功能的影響，為骨組織工程研究活性骨誘導因子提供新思路。 目的： 1.建立和完善MSCs分離和培養(yǎng)技術，最大限度的獲得MSCs。 2.將中西醫(yī)結合治療感染性開放骨折的特色中藥應用于骨缺損的修復研究，觀察生肌液在體內對MSCs增殖和分化的影響，從而進一步加深我們對中藥作用的認識，探索中藥在骨組織工程領域的新應

3、用。 方法： 1.抽取大耳白兔脛骨骨髓，經(jīng)密度梯度離心-貼壁篩選，獲取MSCs并培養(yǎng)、擴增。 2.以纖維蛋白膠和脫基質骨(Dematrix Bone，DMB)為MSCs載體，構建組織工程骨，分別為：空白組(DMB-MSCs復合物)；實驗組包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphgenetic Protein，BMP)組(含BMPDMB-MSCs復合物)、生肌液組(生肌液-DMB-MSCs復合物)、BMP+生肌液組

4、(生肌液-含BMPDMB-MSCs復合物)。 3.制作標準的兔橈骨10mm完全缺損模型，植入已構建的組織工程骨，制作修復模型。 4.術后觀察動物的一般情況，分別于4、8、12、16周攝X線片動態(tài)觀察新生骨痂生長；4、8、12、16周取材進行組織學染色觀察骨缺損修復過程中的細胞學變化；4周進行BrdU免疫組化染色觀察標記的MSCs在骨修復中的作用；8周進行Ⅰ型膠原免疫組化染色觀察骨缺損修復中Ⅰ型膠原的分泌活性、Von Ko

5、ssa染色以及四環(huán)素熒光標記觀察新骨形成狀態(tài)；16周取材進行標本大體觀察和骨密度檢測以綜合評價骨缺損修復情況。 結果： 1.采用密度梯度離心-貼壁篩選的方法，可獲得大量骨髓中的MSCs。MSCs于原代培養(yǎng)13-14天，80％融合，進行傳代培養(yǎng)。傳代后MSCs為成纖維細胞樣形態(tài)結構，呈指紋狀生長，具有強大的增殖能力。 2.動態(tài)放射學和組織學檢查結果提示生肌液-BMP組編織骨生成量最多，成熟也最早；BMP組骨痂生成量

6、和成熟度都強于生肌液組；空白組最差，骨痂生長緩慢，量少且幼稚。 3.組織學觀察發(fā)現(xiàn)骨缺損修復兼有膜內成骨和軟骨內成骨的方式，且新生編織骨貼支架材料生長；含生肌液組新生血管較其它組更豐富。 4.術后4周標本BrdU標記可見支架材料中細胞胞核呈深棕色，顯示植入的MSCs參與了骨缺損修復。 5.術后8周標本四環(huán)素熒光標記觀察四環(huán)素熒光帶的亮度及帶間寬度：BMP+生肌液組>BMP組>生肌液組>空白組。 6.術后8

7、周標本Ⅰ型膠原免疫組化觀察顯示大量骨基質生成，且各實驗組明顯多于空白組。 7.術后8周標本Von Kossa染色顯示骨折斷端和支架材料旁新生編織骨。 結論： 1.采用密度梯度離心-貼壁篩選法，分離大耳白兔骨髓中的單個核細胞層，可獲得具有強大增殖能力、高純度的MSCs； 2.在體內環(huán)境，中藥生肌液具有促進MSCs增殖和分化為成骨細胞的能力。生肌液與BMP復合能極大增強BMP的功能，更加有效的促進成骨；