缺血預適應相關基因WDR26對腦缺血-再灌注損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、腦缺血.再灌注損傷是臨床上常見的病理現(xiàn)象，如腦血管病的手術治療、腦血管意外后的血管自通或者溶栓治療、腦外傷的治療、心肺腦復蘇治療等，都可能發(fā)生腦缺血-再灌注損傷。尋找有效防治腦缺血-再灌注損傷的方法是當代神經(jīng)科學的重要課題之一。腦缺血預適應是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強有力的神經(jīng)內(nèi)源性保護現(xiàn)象。揭示腦缺血預適應的發(fā)生機制并予以利用，對腦缺血-再灌注損傷的防治具有重要意義，也是國內(nèi)外學者關注的焦點。 WDR26基因是最近從大鼠心肌組織

2、中首次克隆的一個在缺血預適應中表達上調(diào)的新基因，定位于染色體1q42.12，含14個外顯子和13個內(nèi)含子，ORF為1，545bp，編碼514個氨基酸，Northern雜交結果顯示其有四個剪切型。采用多組織膜研究發(fā)現(xiàn)，WDR26基因在腦組織中高表達。它是一個典型的WD-重復蛋白。WD-重復蛋白家族成員的序列在真核生物不同物種間均高度保守，在信號轉(zhuǎn)導、蛋白運輸、染色體修飾、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡等多個生命過程中具有重要作用。但WDR26的生

3、物學功能目前尚不清楚。 為了深入探討WDR26在腦缺血預適應及腦缺血-再灌注損傷中的生物學功能，本研究首先通過改良四血管阻斷法制備大鼠腦缺血預適應及缺血.再灌注損傷模型，使全腦缺血3min，分別再灌注3h、6h、12h、24h，然后再行全腦缺血30min，再灌注24h，深麻醉下快速斷頭取腦，進行腦水含量測定。結果發(fā)現(xiàn)，缺血3min再灌注24h后再行缺血30min再灌注24h，腦水含量較假手術對照組明顯減少，而其它實驗組的腦水含量

4、與假手術組無明顯差異；說明缺血3min在灌注24h對其后的腦缺血-再灌注損傷導致的腦水腫具有明顯保護作用。采用real-timePCR檢測腦缺血3min再灌注后WDR26基因在腦組織中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，缺血3min再灌注后WDR26基因在腦組織中的表達較假手術對照組明顯增高，再灌注6小時達到高峰。上述結果提示W(wǎng)DR26的表達增高可能是腦缺血預適應保護機制的一部分。 氧化應激是腦缺血-再灌注損傷的主要損傷機制之一。為了解WDR

5、26對氧化應激所致的神經(jīng)細胞損傷是否具有保護作用，本研究采用H2O2刺激制備氧化應激細胞模型，檢測WDR26基因在氧化應激所致SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤細胞損傷過程中的表達情況；將該基因的最大開放閱讀框架克隆入真核表達載體pCDNA3.1，并轉(zhuǎn)染入SH-SY5Y細胞，建立WDR26過表達細胞株，探討WDR26過表達對氧化應激所致神經(jīng)細胞損傷的影響；采用針對WDR26的反義寡核苷酸（antisense phosphorothioate o

6、ligodeoxynucleotides，asODNs）轉(zhuǎn)染，探討WDR26表達抑制對氧化應激所致神經(jīng)細胞損傷的影響。研究結果發(fā)現(xiàn)，WDR26基因在H2O2所致氧化應激中表達明顯增高；WDR26過表達可明顯抑制H2O2導致的SH-SY5Y細胞凋亡，提高SH-SY5Y細胞的存活率；相反，采用反義寡核苷酸技術使WDR26的表達降低則能夠顯著促進H2O2導致的SH-SY5Y細胞死亡。上述結果表明，WDR26對H2O2所致神經(jīng)細胞損傷具有明顯保

7、護作用。 AP-1是由Fos-Jun或Jun-Jun二聚體構成的具有氧化還原敏感性的轉(zhuǎn)錄復合體，對于內(nèi)源性和外源性ROS引發(fā)的氧化應激均具有重要調(diào)節(jié)作用。因此，本研究采用EMSA和熒光素酶報告基因檢測了WDR26過表達對H2O2所致神經(jīng)細胞中AP-1活化的影響，結果發(fā)現(xiàn)WDR26過表達能顯著抑制H2O2誘導的AP-1的活化。因此，AP-1活化的抑制是WDR26發(fā)揮神經(jīng)細胞保護功能的可能機制之一。 星形膠質(zhì)細胞是一種最主

8、要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要作用。本研究采用U251-MG星形母細胞瘤細胞探討了WDR26對氧化應激所致星形膠質(zhì)細胞損傷的影響。結果發(fā)現(xiàn)，H2O2能夠誘導U251-MG星形膠質(zhì)母細胞瘤細胞中WDR26表達顯著增加；WDR26過表達可明顯抑制H2O2導致的U251-MG細胞凋亡，提高U251-MG細胞的存活率；相反，采用反義寡核苷酸技術使WDR26的表達降低則能夠顯著促進H2O2導致的U251-MG細胞死亡。這些研究結果強烈