毛乳頭細胞及其部分相關生長因子的研究.pdf

1、目的:毛乳頭細胞(dermal papilla cells,DPCs)是一組位于毛囊基底部的真皮源性細胞,對毛囊的生長發(fā)育、周期調(diào)控以及維持毛發(fā)生長起著主導作用。毛乳頭細胞結(jié)構(gòu)或功能的異常是導致毛囊生長失衡的主要起始因素。毛乳頭空間位置隱蔽,給毛乳頭的分離培養(yǎng)帶來了一定困難,但由于其重要的生理作用,人們對毛乳頭細胞的研究一直沒有間斷過,并逐漸成為毛囊生長發(fā)育及周期調(diào)控的研究的熱點。體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞在形態(tài)上類似成纖維細胞,但本質(zhì)上卻不

2、同于成纖維細胞。在生長方式上,培養(yǎng)的毛乳頭細胞最明顯的特征是細胞融合前形成的多層化的細胞團塊,即凝集性生長的特性。但毛乳頭細胞的凝集性生長特性將隨著細胞傳代次數(shù)的增多而逐漸減弱,一般情況下,第7代以后的毛乳頭細胞將失去凝集性生長的能力。凝集性生長是毛乳頭細胞重要的生物學特性之一與毛乳頭細胞的生物學功能密切相關。有研究證明,低傳代毛乳頭細胞的條件培養(yǎng)基能使高傳代毛乳頭細胞恢復凝集生長的現(xiàn)象,毛乳頭細胞在低傳代時許多細胞因子表達呈陽性隨著傳

3、代次數(shù)的增多逐漸轉(zhuǎn)為陰性。由此推測低傳代的毛乳頭細胞分泌或表達的某些生長因子的變化可能與毛乳頭細胞凝集性生長的狀態(tài)有關。已有研究證明,毛乳頭細胞能分泌多種生長因子如血管內(nèi)皮生長因子,肝細胞生長因子,轉(zhuǎn)化生長因子-β,胰島素樣生長因子-Ⅰ等。但具體是何種生長因子,通過何種途徑,起著何種作用還值得進一步研究。對毛乳頭細胞的相關因子進行研究有助于了解毛乳頭細胞在毛囊生長發(fā)育、周期調(diào)控和毛發(fā)生長過程中所起的作用,對毛發(fā)相關疾病的治療及皮膚組織工

4、程學的進展具有重要意義。本實驗旨在通過對毛乳頭細胞的分離培養(yǎng)方法進行改良,獲得足夠的毛乳頭細胞;對體外不同傳代培養(yǎng)的毛乳頭細胞干細胞因子(SCF)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達進行觀察;并觀察SCF及VEGF對體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞生長增殖的影響。
　　 方法:
　　 1毛乳頭細胞的分離培養(yǎng)及一般生長特性觀察。采用改良毛乳頭細胞培養(yǎng)法[1],獲得足夠的細胞培養(yǎng)于10％的DMEM培養(yǎng)基中,置于37℃、飽和濕度、5％的C

5、O2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)。
　　 2α-平滑肌肌動蛋白染色、甲苯胺藍染色、PAS染色鑒定毛乳頭細胞。
　　 3應用免疫組化SP法及流式細胞儀(FCM)測不同傳代次數(shù)的毛乳頭細胞SCF及VEGF的表達變化情況。
　　 4采用MTT比色法繪制毛乳頭細胞生長曲線用于觀察SCF及VEGF對毛乳頭細胞生長增殖的影響。
　　 5運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。

6、r>　　 結(jié)果:
　　 1在毛乳頭的分離過程中我們采用改良毛乳頭細胞培養(yǎng)法,不但節(jié)約了標本并且降低了勞動難度,成功的進行了毛乳頭細胞的分離培養(yǎng)。分離的毛乳頭細胞純度高、貼壁迅速,并且培養(yǎng)的毛乳頭細胞具有典型的生長特性:凝集性生長。凝集性生長的特性隨著傳代次數(shù)的增多逐漸減弱,7代以后完全消失。
　　 2所獲得的細胞經(jīng)免疫組化染色胞漿內(nèi)表達α-平滑肌肌動蛋白;甲苯胺藍染色呈異染性;PAS染色細胞胞漿為紅色。
　　

7、3免疫組織化學法檢測不同傳代次數(shù)的毛乳頭細胞SCF及VEGF的表達情況。SCF及VEGF主要表達于胞漿內(nèi),隨著傳代次數(shù)的增多,表達逐漸減弱。
　　 4流式細胞儀(FCM)測不同傳代次數(shù)的毛乳頭細胞SCF及VEGF的表達情況。用均道值來表示生長因子的表達量。對3代、6代,6代、9代的SCF及VEGF的均道值進行兩兩比較,統(tǒng)計結(jié)果分析具有顯著性差異(P＜0.05),隨著細胞傳代次數(shù)的增多生長因子的表達量不斷減少。
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8、SCF組及VEGF組與對照組相比較,細胞生長曲線的停滯期減少提前進入對數(shù)生長期,SCF組及VEGF組于對照組的OD值相比較明顯升高,統(tǒng)計分析表明有顯著性差異(P＜0.05),可見SCF及VEGF對毛乳頭細胞的生長有明顯的促進作用。
　　 結(jié)論:
　　 1在人毛乳頭的分離過程中我們利用改良毛乳頭細胞培養(yǎng)法,用少量的標本,成功分離到了高純度的毛乳頭細胞,且體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞呈典型的凝聚性生長,α-平滑肌肌動蛋白表達陽性,毛