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文檔簡介
1、目的:
克隆肝細胞生長因子(HGF)基因,構(gòu)建其重組真核表達載體;觀察HGF拮抗經(jīng)足葉乙甙(VP-16)處理后5株細胞的凋亡發(fā)生;轉(zhuǎn)染Raji細胞,觀察HGF基因的表達及對Raji細胞凋亡的影響;構(gòu)建動物模型,觀察HGF的抗凋亡和促血管新生的生物學(xué)效應(yīng),為研究HGF的生物學(xué)效應(yīng)做相關(guān)基礎(chǔ)工作。
方法:
1.HGF基因的克隆與重組克隆載體的構(gòu)建及鑒定
由新鮮人肝組織提取總RNA,行逆
2、轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)獲HGF基因cDNA,與載體pMD19-TSimple連接,構(gòu)建重組克隆載體pMD19-Tsimple-HGF。將重組克隆載體以冷CaCl2法轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α并行氨芐青霉素和α-篩選,采用菌落直接PCR、MluI和SalI雙酶切及序列分析等方法,證實目的片段的存在和序列正確。
2.HGF基因重組真核表達載體的構(gòu)建與鑒定
將轉(zhuǎn)化重組克隆載體pMD19-TSimple-HGF的E.Coli
3、DH5α增菌后,提取重組載體行MluI和SalI雙酶切,行瓊脂糖凝膠電泳分離后將目的片段進行膠回收并測定濃度,與經(jīng)相同雙酶切的載體pVITRO2-mcs提取物連接成重組表達載體pVITRO2-mcs-HGF。將重組表達載體以冷CaCI2法轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α并行潮霉素B(100μg/ml)篩選,經(jīng)菌落直接PCR、MluI和SalI雙酶切等方法確定目標片段的存在。
3.細胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定
4、 在維持底層膠瓊脂糖濃度為0.5%的基礎(chǔ)上,對上層膠瓊脂糖濃度(0.1%~0.5%)和細胞濃度(100個/孔~5000個/孔)進行選擇,改良瓊脂糖半固體培養(yǎng)體系。取對數(shù)生長期的Raji細胞,以終濃度為1×105個/ml分別接種于含10~200μg/ml潮霉素B的RPMI1640培養(yǎng)液,于37℃、5%CO2作靜置培養(yǎng),以培養(yǎng)14天后仍有Raji細胞存活的最低潮霉素B濃度作為篩選用濃度。
4.HGF基因的細胞轉(zhuǎn)染與陽性克隆的鑒
5、定
采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法行重組表達載體轉(zhuǎn)染Raji細胞。37℃、5%CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h后,采用50μg/ml潮霉素B進行篩選。以未處理Raji細胞和僅加脂質(zhì)體Raji細胞為空白對照,以載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染后Raji細胞為陰性對照。取篩選后存活組細胞提取總RNA,行RT-PCR,電泳,檢測HGF基因的存在以確定成功轉(zhuǎn)染。
5.IIGF基因轉(zhuǎn)染后mRNA表達水平的檢測
取第1、7、15代
6、HGF基因轉(zhuǎn)染后Raji細胞培養(yǎng)物提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后采用實時熒光定量PCR,檢測HGFmRNA的表達水平并評價其表達穩(wěn)定性,以未轉(zhuǎn)染Raji細胞和載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組為對照。
6.HGF基因轉(zhuǎn)染后蛋白表達的檢測
取對數(shù)生長期的HGF基因轉(zhuǎn)染后Raji細胞,采用Westernblot、細胞免疫化學(xué)法定性檢測HGF蛋白的表達。此外,分別收集第1、7、15代HGF基因轉(zhuǎn)染后Raji細胞培養(yǎng)物上清液,
7、采用ELISA法定量檢測HGF蛋白的表達,并評價HGF蛋白表達的穩(wěn)定性。以未轉(zhuǎn)染Raji細胞組、載體pVITRO2-mcs轉(zhuǎn)染組作為對照。
7.HGF基因轉(zhuǎn)染對Raji細胞的生物學(xué)性狀的影響
取HGF基因轉(zhuǎn)染Raji細胞分別作半固體克隆培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)和單層細胞培養(yǎng),置37℃、5%CO2作常規(guī)靜置培養(yǎng)。第3天起每天觀察細胞的生長情況至14天,觀察集落形成情況,分別評價HGF基因轉(zhuǎn)染對Raji細胞的增殖、侵襲和遷
8、徙的影響。
8.HGF蛋白抑制腫瘤細胞凋亡的體外實驗
將處對數(shù)生長期的5種腫瘤細胞株(HL-60急性粒細胞白血病細胞系、PC-3前列腺癌細胞系、HeLa宮頸癌細胞系、A549非小細胞肺癌細胞系、Raji淋巴瘤細胞系)分別以1×106/孔接種至6孔板,37℃、5%CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h后,適宜濃度VP-16處理6h,加入HGF(終濃度為100ng/ml),37℃、5%CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h,再按相關(guān)實驗進行
9、操作。以未經(jīng)VP-16處理的細胞和處理的細胞為對照。
9.CCK-8細胞毒性試驗
于96孔板每孔內(nèi)加入100μl細胞,加入VP-16處理,置37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育12h,加10μlCCK-8工作液,孵育1~4h,經(jīng)酶標儀在450nm測定吸光度。
10.HE染色檢測細胞形態(tài)變化
以細胞涂片(Raji、HL-60)或細胞爬片(PC-3、HeLa、A549)方式制片,用95%
10、乙醇常溫固定2-3min,水洗后,行HE染色,光鏡下檢測并計數(shù)。
11.吖啶橙染色檢測細胞凋亡
制備活細胞懸液,濃度約為1×107/ml。取95μl細胞懸液,加5μl吖啶橙貯存液,混勻。吸一滴于潔凈玻片上,蓋玻片封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察并計數(shù)。
12.磷脂酰絲氨酸外翻與核膜完整性分析
采用AnnexinV/PI雙染經(jīng)流式細胞術(shù)檢測。收集對數(shù)生長期的5種腫瘤細胞株(HL-60、P
11、C-3、HeLa、A549、Raji),制備單個細胞懸液,離心,PBS洗滌后bindingbuffer重懸,調(diào)整濃度為1×106/ml。取100μl細胞懸液,加5μlAnnexinV和5μlPI,混勻常溫避光孵育15min,加400μl1×bindingbuffer在1h內(nèi)用流式細胞儀進行檢測。
13.HGF基因轉(zhuǎn)染抗淋巴瘤細胞的凋亡作用的體外實驗
將處對數(shù)生長期的HGF基因轉(zhuǎn)染的Raji細胞,以1×106/
12、孔接種至6孔板,37℃、5%CO2常規(guī)靜置培養(yǎng)24h后,用VP-16(終濃度為100ng/ml)于37℃、5%CO2處理6h,采用同上行CCK-8處理,同時檢測其形態(tài)學(xué)特征(HE染色、吖啶橙染色)和生化特征(AnnexinV/PI)的變化。以未轉(zhuǎn)染Raji細胞和未處理的轉(zhuǎn)染Raji細胞為對照。
14.裸鼠體重和腫瘤體積的測量
Raji細胞接種裸鼠后每7日用游標卡尺測量腫瘤大小一次,并稱裸鼠體重,連續(xù)觀測8周。
13、8周后稱裸鼠體重,拉頸處死裸鼠,剝離皮下腫瘤,測量腫瘤長、短徑。腫瘤體積(V)按公式計算:V=3.14/6×a×b2,其中a為腫瘤的長徑,b為短徑。
15.細胞凋亡指數(shù)的檢測
切片常規(guī)脫蠟,梯度乙醇水化。20μg/ml蛋白酶K室溫消化,采用原位DNA片段末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡。以細胞核中有黑色顆粒者為陽性細胞即凋亡細胞,每例切片至少計數(shù)10個400倍視野,以平均每1000個細胞核中含凋亡細胞個數(shù)
14、作為凋亡指數(shù)。每次實驗設(shè)陰性對照和陽性對照。
16.腫瘤微血管密度的檢測
采用SP法染色,光鏡下進行微血管計數(shù)并取其均值:每張切片先在低倍鏡(100倍)下全面觀察,確定5個血管密度最高區(qū)域,在高倍鏡(200倍)下進行微血管計數(shù),取各區(qū)域均值作為該標本的微血管密度。
結(jié)果:
1.HGF基因的克隆及其重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定
新鮮人肝組織提取總RNA后行RT-PCR,可見
15、一約2.3kb的特異性條帶,與目的片段大小一致(2229bp),提示HGFcDNA片段成功擴增。將構(gòu)建的重組克隆載體pMD19-TSimple-HGF轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α,篩選出陽性菌落。將陽性菌落直接PCR產(chǎn)物、重組克隆載體SalI和MluI雙酶切產(chǎn)物和重組克隆載體提取物等同時電泳,可見存在與目的片段大小一致的特異性條帶(2229bp),提示pMD19-TSimple-HGF重組克隆載體成功構(gòu)建。取純化的重組克隆載體pMD19-T
16、Simple-HGF行測序,序列測定結(jié)果與Genebank報道的序列相同,表明重組于載體的HGF基因片段序列正確。
2.HGF基因重組真核表達載體的構(gòu)建與鑒定
將構(gòu)建的重組表達載體pVITRO2-mcs-HGF轉(zhuǎn)染E.ColiDH5α后采用潮霉素B篩選出陽性菌落。將HGF基因的RT-PCR產(chǎn)物、陽性菌落直接PCR產(chǎn)物、重組表達載體SalI和MluI雙酶切產(chǎn)物、重組表達載體提取物等同時電泳,發(fā)現(xiàn)存在與目的片段大
17、小一致的特異性條帶存在(2229bp),提示重組表達載體pVITRO2-mcs-HGF獲成功構(gòu)建。
3.細胞培養(yǎng)條件及篩選用潮霉素B濃度的確定
采用24孔板進行半固體培養(yǎng)時,低層膠瓊脂糖濃度為0.5%、上層膠瓊脂糖濃度為0.3%、每孔細胞數(shù)為1000個。潮霉素B濃度以50μg/ml作為轉(zhuǎn)染后細胞篩選用濃度。
結(jié)論:
HGF基因獲成功克隆并構(gòu)建了重組真核表達載體pVITRO2-mcs
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