微泡聯(lián)合診斷超聲波開放血腦屏障及促藥跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究.pdf

1、背景與目的： Vykhodtseva首次發(fā)現(xiàn)超聲波能開放血腦屏障，開創(chuàng)了利用超聲技術(shù)穿顱骨治療的新領(lǐng)域，且對(duì)腦組織損傷甚微，擴(kuò)大了無(wú)創(chuàng)性開放血腦屏障的研究前景。這一超聲技術(shù)不同于以往的超聲治療領(lǐng)域，而是利用具有診斷作用的超聲波頻率和強(qiáng)度在一定劑量的超聲造影劑作用下無(wú)創(chuàng)性開放輻照區(qū)的腦部血腦屏障，且這種作用為可逆性開放，達(dá)到了最低危險(xiǎn)程度開放血腦屏障。故超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障成為近年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 血腦屏障本身的特

2、殊解剖學(xué)結(jié)構(gòu)達(dá)到了對(duì)外來物質(zhì)通過的嚴(yán)格選擇性，從而維持了腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，確保腦的正常代謝和生理功能，對(duì)人體大腦起到了很好的保護(hù)作用。在腦部疾病的治療方面，BBB又被認(rèn)為是阻止化療藥物進(jìn)入腦組織進(jìn)而影響療效的主要原因，導(dǎo)致抗癌等藥物無(wú)論是靜脈注射還是動(dòng)脈灌注，都難以在腦組織達(dá)到有效濃度，不能充分發(fā)揮療效，如原發(fā)性腦瘤或繼發(fā)性腦瘤等疾病的治療，均需要藥物直接在腦部發(fā)揮作用。因此藥物在腦組織的療效不僅取決于病灶對(duì)藥物的敏感性，更主要的是取決于

3、血腦屏障對(duì)藥物的通透性，從有創(chuàng)性鞘內(nèi)或腦室穿刺直接給藥產(chǎn)生的技術(shù)操作要求較高且感染風(fēng)險(xiǎn)的限制性應(yīng)用，到對(duì)藥物進(jìn)行脂溶性化學(xué)修飾、改變分子量大小和電荷，設(shè)計(jì)出對(duì)BBB內(nèi)皮細(xì)胞的天然載體如葡萄糖、氨基酸、肽類載體，均是具有高度親和力的水溶性藥物，無(wú)創(chuàng)性促進(jìn)藥物跨過BBB，使之在腦內(nèi)能達(dá)到有效的濃度，是神經(jīng)醫(yī)學(xué)發(fā)展的重點(diǎn)。而通過超聲波技術(shù)構(gòu)建多功能的跨BBB藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也逐步走向新的超聲治療研究領(lǐng)域。 超聲聯(lián)合微泡輻照腦組織，是基于靜

4、脈注射用于增強(qiáng)血管顯影的微泡造影劑后，以一定強(qiáng)度與頻率照射腦部，通過一系列示蹤手段與檢測(cè)方法證實(shí)血腦屏障開放，達(dá)到無(wú)創(chuàng)性可逆開放血腦屏障。 以上關(guān)于超聲聯(lián)合微氣泡開放BBB的確切機(jī)制尚不明確，還需進(jìn)一步的深入研究論證，但可以肯定的是，其原理不同于高滲性溶液和其他有創(chuàng)性開放BBB的方法。本研究的目的是通過建立體外血腦屏障模型，探討超聲聯(lián)合微泡輻照作用下，血腦屏障通透性發(fā)生改變的機(jī)理與安全性，結(jié)合動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)比分析超聲聯(lián)合微

5、泡對(duì)BBB的影響，為將來的臨床治療提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與傳代培養(yǎng)：BALB/c小鼠腦組織塊經(jīng)0.1％胰酶消化后，篩網(wǎng)機(jī)械分離，最后不同密度Percoll液分層得到腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在含有高濃度內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基純化培養(yǎng)后傳代，得到穩(wěn)定的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞源；倒置顯微鏡常規(guī)觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)規(guī)律；BMVEC接種于涂有明膠的蓋玻片上，待生長(zhǎng)呈單層后采用鏈霉親和素生物素過氧化

6、物酶復(fù)合物法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特有VIII因子表達(dá)，鑒定分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否為內(nèi)皮細(xì)胞；透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)；四甲基偶氮唑比色實(shí)驗(yàn)描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 2.將BMVEC培養(yǎng)在具在特殊質(zhì)材和孔徑的Transwell小室上建立BBB體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停辉嚶?shí)驗(yàn)初步判斷BBB的形成；實(shí)時(shí)電阻測(cè)量BBB體外模型跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻；體外BBB模型HRP實(shí)時(shí)通透性實(shí)驗(yàn)；細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、表面形態(tài)與分布、緊密連接蛋白-1行透射電鏡、掃描電鏡、激光共聚焦顯微

7、鏡檢測(cè)。建立體外經(jīng)人顳骨標(biāo)本血腦屏障細(xì)胞模型：顳骨片經(jīng)福爾馬林消毒后涂抹上耦合劑置于細(xì)胞小室上，模擬經(jīng)顱骨超聲聲窗條件，供體池注入微泡后進(jìn)行超聲輻照。 3.超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障通透性的可逆性及安全性評(píng)價(jià)：應(yīng)用水聽器對(duì)研究中所應(yīng)用的超聲探頭進(jìn)行聲學(xué)相關(guān)參數(shù)的測(cè)定，篩選出最佳超聲頻率與強(qiáng)度，為研究超聲引發(fā)相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)提供量化考查指標(biāo)；探討跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻實(shí)時(shí)測(cè)定與通透性發(fā)生改變的關(guān)系；實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞再培養(yǎng)3 d，觀察表面形態(tài)結(jié)構(gòu)改變

8、以及電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的變化，以考察微泡介導(dǎo)下超聲輻照對(duì)血腦屏障通透性影響的發(fā)生機(jī)制與安全性；免疫組化檢測(cè)緊密連接ZO-1蛋白表達(dá)是否與通透性相關(guān)；酶標(biāo)儀檢測(cè)辣根過氧化物酶的通透量，描繪通透曲線，探討通透性增加的規(guī)律。 4.超聲聯(lián)合微泡提高BBB模型通透性的機(jī)理研究：根據(jù)分組在模型中加入自制的脂膜氟烷超聲造影劑，約2.0×107個(gè)左右微泡；采用經(jīng)顱超聲診斷儀輻照，時(shí)間10 min。分為4組，每組4個(gè)樣本：(1)對(duì)照組；(2)微泡組

9、；(3)超聲組；(4)超聲聯(lián)合微泡組。經(jīng)上述處理后，光鏡和電鏡觀察BBB細(xì)胞膜及超微結(jié)構(gòu)改變，免疫組化檢測(cè)緊密連接ZO-1蛋白表達(dá)；在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)TEER和HRP的通透性，探討可逆性開放BBB的機(jī)理。 5.微泡介導(dǎo)診斷超聲波輻照促順鉑跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)研究：根據(jù)是否加入微泡和超聲輻照，分為四組：(1)對(duì)照組；(2)超聲組；(3)微泡組；(4)超聲聯(lián)合微泡組。每組添加濃度為5ng/μl的生物素膠體金50μl和順鉑，順鉑達(dá)到9

10、μg/cm2，供池定容在460μl，分別于超聲輻照后再培養(yǎng)48h，并于再培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)從受池中取樣，待所有取樣結(jié)束后，采用高效液相色譜檢測(cè)順鉑的通透量；透射電鏡觀察細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化以及膠體金的分布；實(shí)驗(yàn)前后細(xì)胞小室行掃描電鏡能譜分析。 6.伊文思藍(lán)示蹤實(shí)驗(yàn)：Sprague-Dawlty大鼠，固定麻醉消毒鋪巾，去除大鼠顱骨，加載經(jīng)處理后的人顳骨標(biāo)本：將各組動(dòng)物按分組給予相應(yīng)處理30min后開胸，插管，灌注，直至從剪開的

11、右心房?jī)?nèi)流出的液體變澄清，開顱取出腦組織，稱重，浸于含甲酰胺液體中，淬取，并用DU800紫外分光光度儀測(cè)定淬取液在EB溶液最大吸收峰處的光密度值得到EB的通透量。 7.超聲聯(lián)合微泡促順鉑跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究：同EB檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過程與步驟處理后，解剖開顱，冰臺(tái)上取出腦組織，迅速在液氮中冷凍，稱重后加入提取液，在冰浴上研磨勻漿，離心20 min，取上清液行HPLC進(jìn)樣分析。 8.硝酸鑭示蹤實(shí)驗(yàn)：經(jīng)顱超聲聯(lián)合微泡引發(fā)血腦屏

12、障通透性改變的機(jī)理研究，配制硝酸鑭固定液與漂洗液；超聲輻照結(jié)束后，各實(shí)驗(yàn)組大鼠在超聲波照射后不同時(shí)點(diǎn)麻醉、開胸、插管，硝酸鑭灌注固定液進(jìn)行灌注，灌注后快速將動(dòng)物以保鮮袋包好后4℃過夜，將過夜的動(dòng)物取出，組織塊大小為1 mm3，隨之將組織塊進(jìn)行相應(yīng)處理包埋，半薄切片定位制成超薄切片，鈾染色，鉛染10s，透射電鏡觀察，拍照。通過體外血腦屏障模型的建議與研究，在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討超聲聯(lián)合微泡對(duì)BBB的影響及促藥跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

13、 主要結(jié)果及結(jié)論： 1.成功建立體外血腦屏障模型：BMVEC培養(yǎng)至匯合后具有典型的“鋪路石”樣外觀；掃描電鏡顯示細(xì)胞形成致密單層，透射電鏡、ZO-1蛋白免疫組化證實(shí)細(xì)胞間形成光滑、連續(xù)、高密度的緊密連接；3H葡萄糖的通透率與實(shí)時(shí)電阻呈負(fù)相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞電阻隨著通透性的增加而減低，建立的BBB體外模型在形態(tài)、電阻和對(duì)大分子物質(zhì)通透性方面具備了BBB的基本特性，掌握好電阻與通透性變化的動(dòng)態(tài)規(guī)律，能夠?yàn)楦黝惔蠓肿游镔|(zhì)跨BBB能力的體外研

14、究機(jī)制提供參考價(jià)值。 2.光鏡和掃描電鏡顯示微泡介導(dǎo)下超聲波輻照，四組樣本細(xì)胞表面無(wú)明顯形態(tài)學(xué)改變和損傷，透射電鏡證實(shí)超聲聯(lián)合微泡組細(xì)胞間緊密連接向橋粒連接過渡，超聲組緊密連接減少，但沒有明顯細(xì)胞連接分離現(xiàn)象；ZO-1緊密連接蛋白免疫組化檢測(cè)于超聲聯(lián)合微泡組局部出現(xiàn)減弱甚至消失，超聲組無(wú)明顯改變；HRP通透率檢測(cè)顯示超聲聯(lián)合微泡組BBB通透率呈波浪形遞增與遞減，18h后完全恢復(fù)，超聲組BBB通透性增加，于30 min內(nèi)恢復(fù)，隨著

15、HRP通透量的減低，TEER逐漸恢復(fù)；電鏡、HRP通透率以及ZO-1蛋白表達(dá)在微泡組和對(duì)照組沒有明顯改變。表明：微泡聯(lián)合診斷超聲波介導(dǎo)下能通過短暫開放緊密連接，降低細(xì)胞間電阻，提高通透率，達(dá)到可逆性開放血腦屏障。 3.2MHz、0.6w/cm2、10 min的診斷超聲聯(lián)合微泡能夠促順鉑跨體外血腦屏障模型的轉(zhuǎn)運(yùn)，透射電鏡觀察到內(nèi)皮細(xì)胞胞飲小體增多，細(xì)胞內(nèi)可見膠體金分布；單純超聲組細(xì)胞間隙可見少量膠體金分布，對(duì)照組和微泡組細(xì)胞內(nèi)外均

16、不能見到膠體金；掃描電鏡能譜分析，各組碳和鋅元素總量都沒有發(fā)生改變，但在超聲組和超聲聯(lián)合微泡組兩種元素的能譜分布發(fā)生轉(zhuǎn)變。經(jīng)HPLC檢測(cè)，順鉑通透量在超聲組與超聲聯(lián)合微泡組高于對(duì)照組與微泡組，組間比較有顯著差異。表明：微泡聯(lián)合診斷超聲波能通過短暫開放緊密連接，促進(jìn)藥物順鉑跨血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)。 4.透射電鏡觀察在體硝酸鑭示蹤實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：對(duì)照組及微泡組鑭顆粒僅位于血管腔中，均勻附著于毛細(xì)血管內(nèi)壁，血管外間隙無(wú)硝鑭顆粒沉積，緊密連接未見開

17、放，神經(jīng)纖維間亦未見有鑭劑沉積；超聲組在電鏡下可見除血管腔有鑭顆粒沉積外，毛細(xì)血管的內(nèi)皮下層、基底膜、神經(jīng)髓鞘間可見鑭顆粒沉積，神經(jīng)元形態(tài)正常，胞膜完整，胞質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器正常；超聲聯(lián)合微泡組能見到血管緊密連接的開放，鑭劑沿著開放的緊密連接處連續(xù)滲出，但外滲的鑭劑并未在周圍出現(xiàn)明顯的聚集，而是沿整個(gè)血管斷面在血管外均勻分布，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)未見鑭顆粒沉積，神經(jīng)元胞核輕度均質(zhì)化，胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)基本正常。 5.順鉑在體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果：超聲