聚集超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　血腦屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）是由大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)膜、周細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞足突共同組成的位于外周循環(huán)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的分界。雖然生理情況下血腦屏障保護(hù)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)不受外來有害物質(zhì)的侵入，但是同時(shí)血腦屏障也阻止了大部分治療性藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間里，由于血腦屏障的存在以及開放血腦屏障方法的局限性，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療發(fā)展受到了極大限制。為了克服這個(gè)難題，

2、人們嘗試了很多方法，但是他們都不能安全有效的開放血腦屏障促進(jìn)治療性藥物進(jìn)入腦組織。隨著低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡靶向性、可逆性、無創(chuàng)性開放血腦屏障的方法出現(xiàn)，這個(gè)局面得到了改善，該方法成為了目前開放血腦屏障最有效的方法，臨床應(yīng)用前景很廣。但是其中所涉及的機(jī)制還不完全清楚。目前的主要認(rèn)識(shí)是低頻聚焦超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)會(huì)作用于血腦屏障上的機(jī)械敏感性離子通道，引起大腦微血管的生化效應(yīng)，增加血腦屏障的跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑的滲透性，引起血腦屏障

3、的開放。我們的目的是首先研究在聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障的過程中，參與大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞跨細(xì)胞途徑的caveolae和caveolin-1的改變情況，從而證實(shí)跨細(xì)胞途徑在該開放血腦屏障過程中的作用;其次是研究caveolin-1可能對(duì)緊密連接蛋白claudin-5的影響，探索跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑可能具有的聯(lián)系。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分:
　　第一部分實(shí)驗(yàn)共分為6個(gè)組，即對(duì)照組、FUS聯(lián)合微泡處理后0h組

4、、FUS聯(lián)合微泡處理后1h組、FUS聯(lián)合微泡處理后2h組、FUS聯(lián)合微泡處理后4h組和FUS聯(lián)合微泡處理后8h組。使用MRI增強(qiáng)掃描測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度值和熒光分光光度計(jì)測(cè)量EB濃度兩種方法進(jìn)行驗(yàn)證，建立聚焦超聲聯(lián)合微泡靶向性、可逆性、無創(chuàng)性開放血腦屏障的SD大鼠模型，并確定我們建立的動(dòng)物模型中血腦屏障開放的時(shí)間規(guī)律。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)共分為4個(gè)組，即對(duì)照組、單獨(dú)使用微泡組、單獨(dú)使用聚焦超聲組和聚焦超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障組。觀察cave

5、olae和caveolin-1的變化情況，并排除聚焦超聲和微泡單獨(dú)使用對(duì)他們的影響。
　　1.使用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察caveolin-1在腦組織中的分布情況，并初步發(fā)現(xiàn)caveolin-1在四個(gè)組中的表達(dá)水平。
　　2.使用qRT-PCR和westem blot實(shí)驗(yàn)分析四個(gè)組中caveolin-1的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　3.使用透射電鏡觀察血腦屏障的超微結(jié)構(gòu)，觀察四個(gè)組中caveolae的數(shù)量變化。
　　第

6、三部分實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組，即對(duì)照組，聚焦超聲聯(lián)合微泡組、非律平干擾組，研究非律平干擾caveolin-1后對(duì)血腦屏障滲透性和緊密連接的影響。
　　1.檢測(cè)EB染料的濃度，確定非律平干擾對(duì)血腦屏障開放的影響。
　　2.使用western blot檢測(cè)caveolin-1和claudin-5的表達(dá)情況，觀測(cè)非律平干擾后caveolin-1和claudin-5的表達(dá)改變。
　　結(jié)果：
　　1.MRI信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)值在FUS聯(lián)

7、合微泡處理SD大鼠后立即增大，F(xiàn)US聯(lián)合微泡處理SD大鼠后1h時(shí)MRI信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)值達(dá)到最高水平，在FUS聯(lián)合微泡處理SD大鼠后4h所測(cè)得的MRI信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)值減小，而到FUS聯(lián)合微泡處理SD大鼠后8h MRI信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)值恢復(fù)至正常水平。
　　2.FUS聯(lián)合微泡處理SD大鼠后腦組織中EB濃度立即升高，F(xiàn)US聯(lián)合微泡處理大鼠后1h EB濃度最高，之后EB濃度降低，當(dāng)FUS聯(lián)合微泡處理大鼠后8h，EB濃度降至正常水平。
　　3

8、.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示caveolin-1主要在大腦微血管中表達(dá)并沿著微血管走形分布;與對(duì)照組相比，微泡組的caveolin-1表達(dá)水平無顯著性差異，而FUS組和FUS聯(lián)合微泡組有顯著性差異(p＜0.01)，并且FUS聯(lián)合微泡組的caveolin-1表達(dá)水平增高最顯著。
　　4.western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，微泡組光密度值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)US組和FUS聯(lián)合微泡組有顯著性差異(p＜0.01)，并且FUS聯(lián)合微

9、泡組中caveolin-1蛋白表達(dá)水平增加最明顯。
　　5.qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，微泡組的caveolin-1基因表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)US組和FUS聯(lián)合微泡組均有顯著性差異(p＜0.01)，并且FUS聯(lián)合微泡組的caveolin-1基因表達(dá)水平增加最顯著。
　　6.透射電鏡結(jié)果顯示在正常對(duì)照組和微泡組的SD大鼠腦組織中，caveolae的數(shù)量很少被觀察到，在FUS組的SD大鼠腦組織中，可以觀察到增多的cav

10、eolae，而在FUS聯(lián)合微泡組的SD大鼠腦組織中，可以觀察到大量增加的caveolae結(jié)構(gòu)。
　　7.使用非律平干擾后，EB濃度較未干擾組低。
　　8.干擾caveolin-1的表達(dá)會(huì)影響緊密連接蛋白claudin-5的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.MRI增強(qiáng)掃描和熒光分光光度計(jì)測(cè)定EB含量的方法得出的結(jié)果一致，我們所使用的聚焦超聲參數(shù)和微泡劑量能夠靶向性和可逆性開放血腦屏障。
　　2.聚焦超聲聯(lián)合微泡處理

11、SD大鼠后1h為最大化開放血腦屏障的時(shí)間點(diǎn)。
　　3.聚焦超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)引起的血腦屏障開放效應(yīng)大于單獨(dú)使用聚焦超聲或者微泡時(shí)引起的血腦屏障開放效應(yīng)之和。
　　4.應(yīng)用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，聚焦超聲聯(lián)合微泡能夠顯著增加大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上caveolin-1的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　5.應(yīng)用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)聚焦超聲聯(lián)合微泡能夠顯著增加大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上ca