SIP1在增生性瘢痕形成中的作用及機制研究.pdf

1、【研究背景】
　　增生性瘢痕的形成是由于各種原因導致的人真皮深層組織損傷致使局部成纖維細胞增殖,膠原合成增加所造成的一種纖維化疾病。大量研究表明,有眾多細胞因子參與創(chuàng)面修復過程,其中轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的作用最為重要,在瘢痕形成中發(fā)揮關鍵作用。TGF-β1的生物學活性主要是通過細胞內Smads家族成員介導。Smads蛋白在細胞核內通過與多種轉錄因子交互作用后

2、調控基因表達。SIP1(Smad interacting protein1,SIP1)可以和Smads蛋白結合,拮抗TGF-β1通路;SIP1還通過結合基因上游特定區(qū)域的方式抑制膠原基因的轉錄。近期Kato M等研究表明,在腎纖維化組織中發(fā)現(xiàn)SIP1低表達,表明TGF-β1介導的腎纖維化與包括SIP1在內的ZEB家族蛋白的缺乏相關。本課題組前期在mRNA水平觀察到:相比較正常皮膚組織,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達,提示了SIP1表達

3、的不足與其纖維化發(fā)生相關。但SIP1在增生性瘢痕形成中的具體作用尚不明確,因此本課題將進一步對SIP1在增生性瘢痕發(fā)病中的分子機制進行深入研究,為臨床增生性瘢痕的預防和治療提供新的理論支持。
　　【研究目的】
　　1.明確SIP1在增生性瘢痕組織和增生性瘢痕成纖維細胞中的表達。
　　2.明確SIP1在增生性瘢痕形成中的作用;體外實驗通過基因轉染技術進行驗證,同時體內實驗應用兔耳瘢痕模型進行驗證。
　　【研究內容】

4、
　　1.應用免疫組織化學和組織免疫熒光的方法檢測增生性瘢痕組織中 SIP1的表達情況;應用細胞免疫熒光檢測增生性瘢痕成纖維細胞中 SIP1的表達情況;應用Western-blot檢測SIP1、α-SMA和COLⅠA2在增生性瘢痕組織中的表達。
　　2.用TGF-β1作用正常皮膚來源的成纖維細胞,檢測其對SIP1、α-SMA和COLⅠA2的表達影響。
　　3.通過構建SIP1過表達腺病毒,并轉染增生性瘢痕成纖維細胞后檢

5、測SIP1和相關纖維化因子α-SMA、COLⅠA2、COLⅢ,及磷酸化 Smad2(P-Smad2)和磷酸化Smad3(P-Smad3)的表達情況;構建兔耳瘢痕模型,觀察SIP1過表達腺病毒對瘢痕膠原纖維的作用。
　　【研究結果】
　　1.免疫組織化學檢測結果顯示,與自體正常皮膚組織相比較,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達。
　　2.組織免疫熒光檢測結果顯示,與自體正常皮膚組織相比較,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達。

6、
　　3.細胞免疫熒光檢測結果顯示,與自體正常皮膚來源的成纖維細胞相比較,SIP1在增生性瘢痕來源的成纖維細胞中低表達。
　　4.Western-blot結果顯示,與自體正常皮膚組織相比較,SIP1在增生性瘢痕組織中低表達,而瘢痕纖維化指標α-SMA和COLⅠA2表達則升高。
　　5.正常成纖維細胞經TGF-β1作用后,Western-blot結果顯示,SIP1的表達逐漸降低;而α-SMA和COLⅠA2的表達則逐漸升高

7、。
　　6.Western-blot結果顯示,在SIP1過表達腺病毒轉染瘢痕成纖維細胞后,α-SMA、COLⅠA2、COLⅢ的表達較對照組明顯下調;當細胞給予 TGF-β1刺激后,各組α-SMA、COLⅠA2、COLⅢ的表達均上調,但SIP1過表達+ TGF-β1組蛋白表達水平仍低于對照+TGF-β1組。
　　7.Western-blot檢測結果顯示,在 SIP1過表達腺病毒轉染瘢痕成纖維細胞后,P-Smad2和P-Smad

8、3的表達較對照組明顯下調;當細胞給予TGF-β1刺激后,各組P-Smad2和P-Smad3的表達均上調,但SIP1過表達+TGF-β1組蛋白表達水平仍低于對照+TGF-β1組。
　　8.為了驗證體外實驗的結果,我們構建兔耳增生性瘢痕模型,SIP1過表達腺病毒注射兔耳增生性瘢痕后,經Masson染色后觀察到,正常兔耳皮膚的膠原淺薄疏松,排列規(guī)整;在對照組、PBS處理組和陰性病毒對照組的真皮層較厚,膠原纖維粗大致密,排列方向紊亂;而在

9、 SIP1過表達腺病毒處理組的兔耳皮下膠原纖維密度下降,排列方向較規(guī)整。
　　【研究結論】
　　1.與自體正常皮膚組織及其來源的成纖維細胞比較,在增生性瘢痕組織及其衍生的增生性瘢痕成纖維細胞中SIP1表達水平顯著下調。
　　2.TGF-β1可誘導正常皮膚來源的成纖維細胞表達α-SMA和COLⅠA2,同時抑制SIP1的表達。
　　3.利用基因轉染技術在瘢痕成纖維細胞中過表達 SIP1后可顯著抑制纖維化相關因子α-S