蘇云金芽孢桿菌的重要功能基因.pdf

1、害蟲(chóng)抗性問(wèn)題已經(jīng)成為蘇云金芽孢桿菌的重要研究課題。不少研究者在尋找新的蘇云金芽孢桿菌主要?dú)⑾x(chóng)基因-cry。PCR-RFLP技術(shù)已被證實(shí)可以快速分析鑒定蘇云金芽孢桿菌菌株的cry和cyt基因型。本研究在繼承前人已經(jīng)成功建立的cry1-cry4、cry7、cry9和cry10鑒定體系基礎(chǔ)上，發(fā)展了cry5、cry6、cry8和cry11的PCR-RFLP鑒定體系，進(jìn)而采用上述PCR-RFLP技術(shù)鑒定了蘇云金芽孢桿菌6株標(biāo)準(zhǔn)菌株和30株武夷山

2、分離株的cry1-cry11基因類(lèi)型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，88.9％、61.1％和2.8％的菌株分別含有cry1、cry2和cry11類(lèi)基因，從供試菌株中檢測(cè)到22種cry基因亞型(cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ad、cry1Ba、cry1Cb、cry1Db、cry1Ea、cry1Eb、cry1Fa、cry1Fb、cry1Ga、cry1Gb、cry1Ka、cry1La、cry1Ia、cry1Ib、cry2Ab、cry2Ac、c

3、ry2Ad、cry2Ae和cry11Aa)。然而，所有供試菌株均未檢測(cè)到cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9和cry10基因型。第一代轉(zhuǎn)基因棉花主要含有cry1Ac。然而多種害蟲(chóng)已經(jīng)對(duì)蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生抗性，而鱗翅目重要害蟲(chóng)小菜蛾在田間條件下已經(jīng)對(duì)Cry1Ac產(chǎn)生了抗性。由于cry2Ab與cry1Ac序列同源性較低，兩者不大可能產(chǎn)生交互抗性，國(guó)外學(xué)者已經(jīng)以cry2Ab基因?yàn)榛A(chǔ)獲得第二代轉(zhuǎn)基因棉花。目前，

4、蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因國(guó)際命名委員會(huì)網(wǎng)站(http：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/)共報(bào)道了7個(gè)cry2Ab基因和1個(gè)cry2Ad基因。本研究從武夷山分離株WB2和WB10中分別克隆到一個(gè)cry2基因(已被蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因國(guó)際命名委員會(huì)命名為cry2Ab8和cry2Ad2)。cry2Ab8全長(zhǎng)1902bp，編碼633aa，所推導(dǎo)的氨基酸序列與已知的Cry2A

5、b基因氨基酸序列同源性最高達(dá)99.5％，與所有已知的Cry2Ab相比存在3個(gè)氨基酸的差異(Ala411Val、Ile629Leu和Ser630Pro)。cry2Ad2全長(zhǎng)1902bp，編碼633aa，所推導(dǎo)的氨基酸序列與Cry2Ad1氨基酸同源性最高(99.4％)，有4個(gè)氨基酸的差異(Asn10Thr、Ser354Pro、Ile629Leu和Ser630Pro)。 蘇云金芽孢桿菌自1901年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直缺乏有效的抗病基因資源

6、。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)在蘇云金芽孢桿菌中存在一種抗病基因aiiA，其表達(dá)產(chǎn)物AiiA能減弱歐文氏菌導(dǎo)致的軟腐病危害。為了有效利用這種新型抗病基因資源，本研究利用PCR技術(shù)初步研究了aiiA基因在芽孢桿菌中的分布情況。結(jié)果表明：在5株蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、29株蘇云金芽孢桿菌武夷山分離株、3株蠟質(zhì)芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和1株枯草芽孢桿菌分離株中均含有aiiA基因。將來(lái)自3株蘇云金芽孢桿菌武夷山分離株、2株蠟質(zhì)芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和BS-1的aiiA

7、進(jìn)行分子克隆。在線核苷酸序列BLAST分析結(jié)果表明：我們克隆到的aiiA基因與NCBI微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的3株炭疽芽孢桿菌(GenBank登錄號(hào)AE017035、AE017334和AE017225)中的部分片段和其它已知的aiiA基因有95％-99％同源性。所克隆得到的aiiA基因推導(dǎo)的氨基序列比對(duì)結(jié)果表明，它們均含有2個(gè)已知相對(duì)保守的蛋白保守區(qū)103SHLHFDH109、165HTPGHTPGH173。此外，我們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的相對(duì)

8、保守的蛋白保守區(qū)187LLTIDASYT195。由于保守區(qū)一般位于酶構(gòu)象中重要位點(diǎn)，有理由可以預(yù)測(cè)AiiA抗病性存在差異的根本原因在于保守區(qū)的差異。GST和來(lái)自枯草芽孢桿菌的aiiA基因的原核融合表達(dá)研究結(jié)果表明：來(lái)自BS-1的AiiA對(duì)歐文氏菌胡蘿卜亞種菌株Dya具有較明顯的防治效果。 研究者經(jīng)常應(yīng)用質(zhì)粒載體進(jìn)行基因工程菌的構(gòu)建。然而由于外源質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，工程菌容易丟失外源基因。此外，多數(shù)質(zhì)粒載體均含有對(duì)環(huán)境具有潛在安全性問(wèn)

9、題的抗生素抗性基因。近年來(lái)，研究人員發(fā)展了一種新型的插入序列整合載體。這種載體可以把目的基因整合到受體菌的基因組上，而載體的余下部分則經(jīng)高溫處理后從受體菌中消除。為了研究插入序列的特性，并嘗試?yán)闷錁?gòu)建對(duì)環(huán)境友好的高效工程菌，本文檢測(cè)了131株蘇云金芽孢桿菌中的插入序列IS231。結(jié)果表明，20株供試蘇云金芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均含有IS231,而在111株蘇云金芽孢桿菌中國(guó)分離株中也檢測(cè)到107株含有IS231。從9株標(biāo)準(zhǔn)菌株中克隆得到3個(gè)

10、新的插入序列IS231(IS231J、IS231O和IS231Q)、6個(gè)IS231異構(gòu)體和1個(gè)新的移動(dòng)插入盒(mobileinsertioncassette)MICBth4。有意思的是，在線BLAST結(jié)果表明，IS231J5'端495bp序列與已報(bào)道的vip1Ac基因(GenBank登錄號(hào)AY245547)3'端下游序列同源性高達(dá)99％。采用PHYLIP軟件(版本3.6b)的鄰位相連法和除權(quán)平均法分別構(gòu)建和分析了IS231的進(jìn)化樹(shù)。

11、 隨著2004年第一個(gè)蘇云金芽孢桿菌全基因組序列的公布，蘇云金芽孢桿菌功能基因組學(xué)的相關(guān)研究已成為一個(gè)新的研究趨勢(shì)。眾所周知，蘇云金芽孢桿菌在不同生長(zhǎng)階段表達(dá)不同的毒力相關(guān)因子。為更好地了解蘇云金芽孢桿菌分化發(fā)育進(jìn)程與其毒力的關(guān)系，本研究利用一種新型轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究手段—任意引物PCR技術(shù)(RAP-PCR)檢測(cè)了蘇云金芽孢桿菌8010處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、孢子期和裂解期5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)的差異，克隆并鑒定了15個(gè)可能差異表達(dá)基因的cDNA

12、片段。利用特異引物RT-PCR證實(shí)其中6個(gè)為真正的差異表達(dá)基因，分別與芽孢桿菌屬外孢囊蛋白、依賴(lài)于ATP的蛋白酶La、3-羥丁酰輔酶A脫水酶、苯醌氧化還原酶、尿苷激酶、3-甲基-2-氧代丁酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶有很高的核苷酸序列同源性。這些蛋白多與蠟質(zhì)芽孢桿菌芽孢形成和適應(yīng)環(huán)境脅迫、物質(zhì)合成和能量代謝有關(guān)。推測(cè)依賴(lài)于ATP的蛋白酶La的表達(dá)可能由環(huán)境脅迫誘導(dǎo)，并受到一個(gè)基因簇的調(diào)控。綜上所述，本研究獲得了一些重要的功能基因。在第2章，本研究完善

13、了前人cry基因鑒定體系，為新基因的發(fā)現(xiàn)、利用及高效廣譜菌株的快速篩選提供技術(shù)支持，獲得了兩個(gè)cry2新基因(cry2Ab8和cry2Ad2)。Cry2Ab已被證明對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有較高活性，而Cry2Ad的研究未見(jiàn)正式報(bào)道。因此，所獲得的兩個(gè)cry2新基因?yàn)闃?gòu)建基因工程菌和轉(zhuǎn)基因植物提供了良好的材料。通過(guò)第3章的研究，我們?cè)赼iiA基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的相對(duì)保守的區(qū)段187LLTIDASYT195。同時(shí)，在構(gòu)建aiiA枯草芽孢桿菌工

14、程菌的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌(內(nèi)生亞種菌株BS-1)中存在aiiA基因，這個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了枯草芽孢桿菌的抗病基因家族。BS-1aiiA基因測(cè)序結(jié)果、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、原核表達(dá)和生物活性測(cè)定均表明它可以降低歐文氏菌胡蘿卜亞種導(dǎo)致的軟腐病危害程度。來(lái)自BS-1的aiiA基因不僅具有科學(xué)研究?jī)r(jià)值，也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在第4章，我們獲得了4個(gè)新的插入序列，這些工作為進(jìn)一步構(gòu)建插入序列整合載體提供了良好的條件，為構(gòu)建高效抗病工程菌奠定了基礎(chǔ)。