選擇復(fù)制性腺病毒載體攜帶自殺基因Dm-dNK（果蠅脫氧核糖核苷酸激酶）的抗腫瘤研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一。根據(jù)最新的全球腫瘤統(tǒng)計(jì)報(bào)告，乳腺癌在女性中發(fā)病率最高，且為女性癌癥死亡的主因。在中國，其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)且更加年輕。以手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療為主的綜合治療模式可以使患者獲得較高的生存率，但仍有很高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率。另外，對(duì)于復(fù)發(fā)性和晚期乳腺癌患者，目前為止也沒有好的治療方法。因此，探索治療乳腺癌的新方法具有重要的臨床價(jià)值，隨著分子生物學(xué)基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，分子治療逐

2、漸開始應(yīng)用于臨床疾病的研究，其中的分子化療即自殺基因療法顯示出良好的應(yīng)用前景。
　　溶瘤病毒(oncolytic virus)是近年來發(fā)展非常迅速的一種腫瘤治療策略，并已取得一些令人鼓舞的研究成果。溶瘤病毒能靶向性感染腫瘤細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，殺死腫瘤細(xì)胞。目前，國內(nèi)外正在研究開發(fā)的溶瘤病毒有十多種。而其中增殖型腺病毒又稱選擇復(fù)制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus，CRAd)，由于可利

3、用腫瘤與正常組織細(xì)胞間結(jié)構(gòu)及代謝途徑的差異，靶向性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，最終裂解腫瘤細(xì)胞，而成為研究熱點(diǎn)之一。
　　pZD55載體（即在腺病毒E1b區(qū)除去55KD基因），是一種新型選擇復(fù)制型腺病毒載體。pZD55與經(jīng)典的ONYX-015基本相似，它們能專門進(jìn)入p53功能缺失的腫瘤，并將后者殺死。但前者構(gòu)建的方法與ONYX-015完全不同，前者是Ad5;后者為Ad2/Ad5融合病毒。尤其重要的是pZD55含有克隆位點(diǎn)可以插入外源抗

4、癌基因而成為pZD55-gene，即構(gòu)成靶向基因-病毒治療，而ONYX-015則不可能。
　　我們?cè)诠壎嗟孜锩撗鹾颂呛塑账峒っ赴被嵝蛄兄凶詈?0位予以隨機(jī)突變，突變后的氨基酸分別為第244位谷氨酸、245位絲氨酸、251位絲氨酸、252位蘇氨酸，形成一個(gè)突變型果蠅多底物脫氧核苷酸激酶(Dm-dNKmu)。利用選擇復(fù)制型腺病毒載體將Dm-dNK基因或者Dm-dNKmu基因?qū)肴橄侔┘?xì)胞系MCF-7，MBA-MD-231和Bcap

5、-37，加入不同濃度的不同核苷類藥物做MTT實(shí)驗(yàn)，分析Dm-dNK對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用及不同癌細(xì)胞系對(duì)Dm-dNK的敏感性后，進(jìn)而做荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討Dm-dNK/核苷類似物對(duì)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)外的影響，建立一種新的自殺基因治療方式，為有效干預(yù)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　乳腺癌腫瘤細(xì)胞系MCF-7，MDA-MB-231和Bcap-37購買于上海細(xì)胞庫，正常細(xì)胞購買于ATCC.細(xì)胞使

6、用L-15培養(yǎng)基或高糖DMEM培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有10％的血清，雙抗。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5％CO2.
　　二、腺病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　根據(jù)Dm-dNK和Dm-dNKmu的cDNA，在其兩端設(shè)計(jì)出帶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn)的引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將Dm-dNK/Dm-dNKmu克隆到質(zhì)粒載體pENTER12中，質(zhì)粒pENTER12包含有CMV啟動(dòng)子，多克隆位點(diǎn)和SV40 polyA尾，pENTER12-dN

7、K與質(zhì)粒PPE3-RC利用內(nèi)切酶LR重組，并與質(zhì)粒pZD55共轉(zhuǎn)染至腺轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞HEK293細(xì)胞，9-14天后出現(xiàn)病毒空斑，利用DNA提取試劑盒抽提重組后病毒的DNA，通過PCR驗(yàn)證后命名為ZD55-dNK/ZD55-dNKmu。復(fù)制缺陷5型腺病毒Ad-GFP用于比較不同細(xì)胞系間感染率的區(qū)別。
　　三、酶活性測(cè)定
　　通過提取細(xì)胞的蛋白，用放射性[3H]標(biāo)記作為底物的核苷酸藥物，混合液在Whatman DE-81濾紙上

8、反應(yīng)不同時(shí)間后經(jīng)液閃測(cè)量儀測(cè)定放射活性。
　　四、Dm-dNK基因的表達(dá)
　　用TRIZOL方法提取純化ZD55-CMV-DNK病毒感染后的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7;人胚肺成纖維上皮細(xì)胞株MRC-5、WI38，使用反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　五、CPE實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞殺傷
　　取對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，24h細(xì)胞貼壁后，吸去上清，按MOI=0，

9、0.1，1，10，100加入病毒，設(shè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液，每孔加1ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照
　　六、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪板，按合適密度鋪板，分別感染病毒，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液，每組加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后24h加入前藥或PBS感染后48h結(jié)束實(shí)驗(yàn)。根據(jù)AnnexinⅤ-FITC/PI試劑使

10、用說明調(diào)整細(xì)胞為106個(gè)/ml，離心棄上清，加入10μlAnnexinⅤ-FITC和5μl PI，輕搖勻，室溫避光反應(yīng)15min，1h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，各組細(xì)胞用流式細(xì)胞計(jì)量儀分別進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　一、選擇復(fù)制型腺病毒載體質(zhì)粒ZD55-CMV-dNK構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:
　　通過基因操作方法將腫瘤治療基因Dm-dNK，順向插入到pENTR-12的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建成PENTR12-Dm-dNK質(zhì)粒。該質(zhì)粒與PPE3-c

11、cdB重組，用Lipofectamine2000將PPE3-CMV-DNKmu質(zhì)粒與SG502共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，應(yīng)用PCR進(jìn)行鑒定。電泳證實(shí)CMV啟動(dòng)子長度為521bp，Dm-dNK序列長度為779bp。由表達(dá)綠色熒光蛋白的野生5型腺病毒(Ad5-GFP)感染來確定病毒對(duì)細(xì)胞系的感染率。結(jié)果乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF7正常細(xì)胞系WI-38、MRC-5表現(xiàn)出基本相同的感染率。
　　二、Dm-dNK基因的表達(dá)及酶活性的

12、檢測(cè)
　　重組腺病毒ZD55-CMV-dNK感染細(xì)胞后的激酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示感染后的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7酶活性明顯高于沒有感染病毒的乳腺癌空白細(xì)胞系，也明顯高出重組腺病毒ZD55-CMV-dNK感染正常細(xì)胞MRC-5、WI38。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒ZD55-CMV-dNK乳腺癌細(xì)胞Dm-dNK基因高表達(dá)，在正常細(xì)胞低表達(dá)。
　　三、Dm-dNK基因聯(lián)合核苷類似物對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用

13、>　　通過MTT及流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZD55-CMV-dNK對(duì)乳腺癌細(xì)胞選擇性殺傷作用。MTT結(jié)果顯示:ZD55-CMV-dNK病毒和ZD55病毒分別感染乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常細(xì)胞系MRC-5，WI-38，前者聯(lián)合Bvdu或Dfdc更能有效的殺傷乳腺癌細(xì)胞(p＜0.05)，然而在正常細(xì)胞中，ZD55-CMV-dNK與ZD55相比，二者聯(lián)合Bvdu或Dfdc對(duì)下常細(xì)胞MRC-5，WI-38殺傷效果

14、無差異(p＞0.05)。而且Dfdc比Bvdu對(duì)Dm-dNK的底物特異性更高。AnnexinⅤ-PI雙染流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，ZD55-CMV-dNK感染后加Dfdc能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞MRC-5影響輕微，對(duì)照空載病毒ZD55聯(lián)合Dfdc殺傷效果小。
　　四、ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc或 Bvdu抑制腺病毒增殖
　　TCID50方法檢測(cè)病毒ZD500-CMV-dNK、ZD55、dl1520和

15、WtAd感染后的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常細(xì)胞系MRC-5，WI-38，加入不同化療藥物Dfdc和Bvdu，收集加藥后的細(xì)胞及上清檢測(cè)病毒滴度變化，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231、MCF-7中，ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc和Bvdu治療病毒滴度均下降，而Dfdc下降最為明顯，其他病毒沒有發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。Western Blot方法對(duì)病毒早期轉(zhuǎn)錄單位E1A的檢測(cè)也證實(shí)了這一點(diǎn)。
　　五、Dm-dNK

16、基因聯(lián)合核苷類似物對(duì)裸鼠移植瘤的抑制作用
　　ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc對(duì)裸鼠MCF-7/Bcap37乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤治療。注射PBS的對(duì)照組腫瘤體積明顯增大，而注射腺病毒ZD55組，尤其是ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc處理組腫瘤增長得到明顯抑制。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)相吻合。
　　六、ZD55-CMV-DNK聯(lián)合Dfdc延長移植瘤裸鼠生存期
　　ZD55-CMV-dNK/Dfdc系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)有DM-dNK

17、的乳腺癌MCF-7/Bcap37細(xì)胞轉(zhuǎn)移瘤治療后裸鼠的生存期較轉(zhuǎn)移瘤PBS處理組，轉(zhuǎn)移瘤ZD55處理組延長。
　　結(jié)論：
　　我們構(gòu)建的增殖型溶瘤腺病毒ZD55-dNK/dNKmu，能夠使Dm-dNK/dNKmu特異性的在乳腺癌細(xì)胞系中高水平表達(dá)，并保持蛋白激酶活性。同時(shí)，溶瘤病毒的瘤裂解作用，配合Dm-dNK持續(xù)磷酸化作為底物的核苷酸類似物BVDU和DFDC，可通過凋亡方式導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，對(duì)正常細(xì)胞影響甚微。