小鼠胚胎干細胞SM22α-EGFP表達克隆的建立及血管平滑肌細胞體外發(fā)育的動態(tài)觀察.pdf

1、研究背景及目的:動脈粥樣硬化、再狹窄及高血壓等心血管疾病的重要特點之一是血管平滑肌細胞(VSMCs)的異常生長及增殖。成熟動物體內(nèi)的VSMCs可表達一系列收縮蛋白、離子通道及信號分子，這些蛋白對于VSMCs的首要功能——收縮是必需的。然而，在各種損傷性刺激的作用下，VSMCs可以去分化，由靜止的收縮表型向增殖能力明顯加強的合成表型轉換。了解VSMCs發(fā)育及分化的過程不僅有助于闡明如何在心血管病中阻斷這一異常轉換，而且對了解先天性血管發(fā)育

2、缺陷及腫瘤的血管發(fā)育至關重要。然而，目前對于VSMCs特異分化及終末分化誘因的研究非常有限，原因之一是缺乏一種合適的VSMCs發(fā)育模型。由于在體內(nèi)無法獲得發(fā)育早期的VSMCs，胚胎干細胞(ESCs)為早期VSMCs的譜系形成、分化及成熟機制的研究提供了一種有價值的體外模型。ESCs的特點是可以在培養(yǎng)期間長期保持未分化狀態(tài)，同時保留分化成任何一種三胚層來源細胞的能力。在體外，ESCs可以自發(fā)地分化成胚胎小體(EBs)。EBs可以生成高度分

3、化的細胞，包括VSMCs，并可以模擬早期胚胎發(fā)育時的許多過程。因此，本研究的目的是對ESCs來源的VSMCs進行標記并對其進行動態(tài)觀察。我們建立了在VSMCs特異性蛋白SM22α啟動子控制下穩(wěn)定表達增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的ESCs株，證明這些轉基因的ESCs在發(fā)育早期可以表達VSMCs特異性的EGFP，并使一群EGFP陽性、具有VSMCs形態(tài)及免疫細胞化學特性的細胞亞系得到了確認。 材料與方法: 1.細胞培養(yǎng)小鼠

4、ESC細胞株R1(ATCC)培養(yǎng)于絲裂霉素(10μg/mL，2h)處理后的滋養(yǎng)層細胞STO(小鼠成纖維細胞株)上。ESCs在生長到亞融合狀態(tài)時行傳代，每天換液以維持其未分化狀態(tài)。 2.載體構建541bp的VSMCs特異性SM22α啟動子序列經(jīng)PCR法獲得。將該片段插入到T載體中構成PTSM載體，再經(jīng)SAC-1及APA-1雙酶切后亞克隆至無啟動子的EGFP報告載體(PEGFP-1)中構成PSM-EGFP載體。 3.ESCs

5、轉染用電穿孔法將線性化的PSMEGFP載體轉染到ESCR1細胞。將轉染后的ESCs(SM22α-EGFP)在含G418的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)和篩選。將擴增后10d的轉基因ESCs于解剖顯微鏡下用Pasteur槍頭挑取1.5mm～2mm的細胞克隆行擴增培養(yǎng)。 4.基因組PCR鑒定應用TaqPCR試劑盒行基因組DNAPCR分析。所擴增片段為PEGFP-1載體中EGFP的cDNA序列。 5.ESCs分化及EBs模型的建立ESCs

6、細胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25％胰酶及0.53mmol/LEDTA消化后，鋪于明膠包被的培養(yǎng)皿中，3h后大部分STO細胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液除無LIF外與ESCs培養(yǎng)液相同。懸浮培養(yǎng)后6d，將EBs接種于0.1％明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，每天換液。 6.免疫細胞化學染色固定的EBs經(jīng)0.05mol/LTBS中洗滌后，在含0.25％TritonX-100和0.5mol/LNH4Cl的TBS

7、中通透20min。5％牛血清白蛋白室溫封閉1h后，與一抗在4℃孵育過夜?？剐∈罂贵w包括SMα-actin、Flk-1、Caspase-3及SMMHC。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)或FITC標記抗體。 7.RT-PCR參照說明書用Trizol提取不同時間點EBs中的RNA。取1μgRNA進行以下物質的半定量PCR：Pecam-1(CD31)、SM22α、myocardin、EGFP及GAPDH。 8.慢速顯微攝

8、像技術(time-lapse)將EBs接種于35mm培養(yǎng)皿中，置5％CO2，37℃恒溫小室，在配有自動攝像裝置(CoolSNAPfx)的倒置相差顯微鏡(OlympusⅨ-70)下觀察細胞移行，每隔10min作序列攝影，連續(xù)拍攝39張，共6.5h。遷移速率采用圖像分析軟件(Image-ProPlus5.1)示蹤程序對累積移行距離及速率實施分析測定。 結果: 1.SM22α-EGFP表達載體構建及陽性ESCs克隆篩選以小鼠S

9、TO細胞DNA為模板擴增得到541bp特異性目的基因片段，與預期片段大小一致。為驗證插入序列，分別對PTSM和PSME-GFP兩種質粒行ECORⅠ和SMAⅠ酶切鑒定，酶解產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析證實片斷大小與理論計算相符合。用電穿孔法將線性載體轉染至ESCs，隨后對轉染ESCs實施篩選，轉染后第6d可見G418耐藥性克隆。共擴增24株ESCs細胞克隆，有4株經(jīng)基因組PCR證實為陽性。以下實驗結果均來自1號克隆，為4株陽性克隆之一

10、。 2.EBs模型的建立及形態(tài)特征R1細胞在STO細胞上呈團生長，細胞致密，邊界不清。EBs從第3d開始形成，此后體積逐漸增大。在第6d可見EBs中心部分透光性逐漸減弱，呈黑色壞死區(qū)，Caspase-3免疫熒光染色可見EBs中心存在大量凋亡細胞。第6dEBs貼壁后可向四周分化延伸出各種形態(tài)細胞，免疫熒光染色證實有VSMCs形成。 3.ESCs細胞分化過程中VSMCs特異性EGFP的表達時相為分析VSMCs分化表達SM22

11、α-EGFP的時間變化特征，觀察不同時間點EBs分化細胞中EGFP的表達。發(fā)現(xiàn)EBs在第6+5d(懸浮培養(yǎng)6d后貼壁培養(yǎng)5d)細胞表達熒光，EGFP陽性細胞隨培養(yǎng)時間延長逐漸增多，在第6+24d達到高峰。EGFP表達主要定位于細胞漿內(nèi)。SM22α啟動子可在體內(nèi)VSMCs中特異性地被啟動。與肌動蛋白異構體不同的是，SM22α只在VSMCs中表達。此外，與鈣調(diào)蛋白、肌動蛋白相關蛋白(metavinculin)及肌球蛋白重鏈不同之處在于SM2

12、2α無剪接變異體。SM22α的啟動子序列較短，更易克隆。已有研究顯示，轉錄起始位點上游441bp的SM22α啟動子足以啟動基因的表達，這一點在本實驗中得到了進一步證實。 4.EBs中分子標志物的表達為了進一步驗證EGFP陽性細胞系VSMCs，選取第6+17dEGFP陽性的EBs。免疫熒光染色證實EGFP陽性細胞SMα-actin及SMMHC染色均為陽性，表明SM22α-EGFP轉染ESCs細胞中報告基因表達具有VSMCs特異性。

13、對不同時間點ESCs分化形成的EBs實施RT-PCR分析，隨時間的延長EGFP及VSMCs特異性標志物表達水平逐漸增加，同時觀察到內(nèi)皮細胞(ECs)特異性標志蛋白PECAM-1具有相同的表達時相，提示在EBs分化過程中有ECs形成。在野生型ESCs分化形成的EBs中亦觀察到VSMCs分化伴有ECs生成。本實驗結果顯示，在EBs模型中SM22α啟動子能啟動VSMCs特異性EGFP表達，進一步用免疫熒光染色及RT-PCR證實EGFP陽性細胞

14、可以表達其它VSMCs特異性標志物，從而證實這些細胞為VSMCs，而不是心肌或骨骼肌細胞。先前的在體內(nèi)實驗與本實驗結果一致：SM22α啟動子只啟動心血管系統(tǒng)SMCs報告基因的表達，而內(nèi)臟系統(tǒng)SMCs無報告基因表達，提示SM22α控制下的報告基因具有心血管系統(tǒng)特異性。 5.VSMCs異質性采用本模型可以觀察到VSMCs形態(tài)呈多樣性。大致可分為兩類：①紡錘形，散在分布于EBs的延伸細胞中；②上皮樣多角形細胞，成群出現(xiàn)，主要位于細胞密

15、度最大的EBs中心部位。此外，兩種細胞的遷移速率不同，前者移行伴有明顯的細胞收縮變形，后者相對維持原有細胞形態(tài)。紡錘形細胞的遷移速率較上皮樣多角形細胞的速率快。形態(tài)和遷移速率的差異提示可能存在兩種表型VSMCs。獲得整合有SM22α-EGFP序列的ESCs具有以下幾個意義：首先，證明了SM22α啟動子在EBs模型中的調(diào)控表達具有VSMCs特異性。人SM22α啟動子序列可以對骨髓基質細胞分化而來的VSMCs進行分選。其次，該模型可以容易地

16、檢測到EBs的每一個細胞中SM22α啟動子的活性，而以前胚胎發(fā)育研究中沿用的報告基因多數(shù)是lacZ(β-半乳糖苷酶)，其分析過程較本法繁瑣費時。第三，SM22α-EGFPESC克隆為篩選VSMCs分化所用誘導劑及抑制劑提供了一個較好的培養(yǎng)體系。最后，重組的ESCs可培育出VSMCs中有EGFP表達的小鼠，用于針對VSMCs在各種病理條件下分化調(diào)節(jié)機制的研究。利用整合有SM22α-EGFP序列的ESCs，結合相關細胞因子協(xié)同的有序誘導，能

17、夠建立一套高效誘導ESCs細胞分化為VSMCs的誘導培養(yǎng)體系。本模型中的兩種不同形態(tài)細胞是否能代表成體VSMCs的增殖及遷移表型，以及它們之間VSMCs特異性基因表達譜的差異還需進一步研究證實。 結論:應用PCR等方法成功克隆SM22α-EGFP表達載體，并應用電穿孔方法成功轉染ESCsR1細胞，建立SM22α-EGFP表達克隆株。ESCs通過懸浮培養(yǎng)，建立EBs模型。在該模型中觀察到VSMCs和ECs的分化。起源于SM22α-