腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制研究.pdf

1、目的：本研究通過對86株碳青霉烯類抗生素耐藥或敏感性降低的腸桿菌科細菌進行β-內酰胺酶、外膜蛋白和外排泵檢測，旨在闡明腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的分子機制；通過碳青霉烯酶基因周圍序列分析，探討碳青霉烯耐藥基因的傳播機制。
　　 方法：瓊脂稀釋法測定抗生素對細菌的最低抑菌濃度(MIC)。脈沖場凝膠電泳和腸桿菌基因間重復性一致序列-PCR(ERIC-PCR)分析菌株之間的同源性。等電聚焦電泳、PCR擴增和序列分析確定菌株所產

2、β-內酰胺酶的類型。質粒接合試驗、質粒消除試驗和Southern blot雜交驗證碳青霉烯耐藥基因是否位于質粒上。提取細菌的外膜蛋白作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，檢測外膜蛋白表達情況。羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制試驗檢測細菌中是否存在針對碳青霉烯類抗生素的外排泵。用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ對碳青霉烯酶基因編碼質粒進行酶切分型。對部分碳青霉烯酶基因編碼質粒進行測序，分析碳青霉烯酶基因周圍DNA序列的基

3、因結構。
　　 結果：86株菌株對碳青霉烯有不同程度的耐藥，亞胺培南、美羅培南和厄他培南的敏感率分別為43.0％、44.2％和1.2％，其它β-內酰胺類抗生素和環(huán)丙沙星的耐藥率和耐藥水平均很高，多粘菌素B的敏感率最高(92.9％)，阿米卡星次之(80.2％)。同一醫(yī)院內的菌株多數(shù)具有同源性，存在克隆傳播現(xiàn)象。82株菌株產KPC-2型碳青霉烯酶，5株產IMP型金屬β-內酰胺酶（其中3株同時產KPC-2），2株檢測不到碳青霉烯酶。T

4、EM-1、SHV-11/-12和CTX-M-14/-M-3等β-內酰胺酶的檢出率非常高，大部分菌株同時產多種酶。大多數(shù)菌株可通過接合試驗將碳青霉烯耐藥性傳遞給大腸埃希菌。Southern blot雜交顯示blaKPC-2基因位于50kb的可接合質粒上。4株肺炎克雷伯菌（包括2株檢測不到碳青霉烯酶的菌株）由于ompK36基因中存在插入序列或堿基突變而缺失OmpK36膜孔蛋白，一株陰溝腸桿菌缺失一個38kDa的外膜蛋白，弗勞地檸檬酸桿菌的兩

5、個外膜蛋白表達量均明顯下降。CCCP不能降低亞胺培南對細菌的MIC值。
　　 82株產KPC-2菌株的blaKPC-2基因編碼質?？筛鶕﨓coRⅠ和HindⅢ的限制性酶切圖譜分為11種類型（Ⅰ型-Ⅺ型），大部分質粒(62/82)為Ⅰ型，其次為V型(8/82)。選?、裥?pKP1)和V型(pKP20)質粒各一個進行測序，pKP1質粒獲得7788bp的DNA序列，pKP20為6000bp。兩個質粒的blaKPC-2基因周圍序列中均含

6、有多個轉座相關元件。pKP1質粒依次編碼Tn3轉座酶、Tn3解離酶、ISKpn8轉座酶、KPC-2和ISKpn6-like樣轉座酶等蛋白。pKP20質粒依次編碼IS26轉座酶、Tn3解離酶截短蛋白、ISKpn8轉座酶、KPC-2、ISKpn6樣轉座酶截短蛋白和IS26轉座酶等，其中Tn3解離酶截短蛋白、ISKpn8轉座酶、KPC-2和ISKpn6樣轉座酶截短蛋白基因等部分與pKP1質粒相同（共3354bp）。根據pKP1和pKP20質粒

7、的DNA序列設計引物對其它80個blaKPC-2基因編碼質粒進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)，大部分質粒(69/82)的PCR擴增結果與pKP1質粒相同，8個V型質粒的PCR結果與pKP20質粒相同。除3個質粒外，其余質粒均具有共同的3354bp序列。另外2個質粒中檢測到了2種變異體。
　　 結論：同一家醫(yī)院內碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細菌主要以克隆株的形式傳播。碳青霉烯酶尤其是KPC-2的產生是腸桿菌科細菌對碳青霉烯耐藥的主要原因，碳青