天蠶素A-蛙皮素雜合肽及其突變體在大腸桿菌中的融合表達.pdf

1、目的：優(yōu)化設計CA-MA雜合肽基因，尋找合適的突變位點，利用PCR技術對CA-MA基因進行定點突變，并將天然型(CA-MA)與突變型(W16-CA-MA)分別在大腸桿菌中融合表達，進行初步的純化，為進一步研究CA-MA結構與功能的關系奠定基礎。 方法:根據Genebank中CA-MA DNA序列及氨基酸殘基序列，按照Codon Usage Database中大腸桿菌偏愛密碼子原則對CA-MA基因進行優(yōu)化設計。利用基因重組技術構建

2、克隆重組體pUC-18-CA-MA，轉化至大腸桿菌DH5a中，經a 互補篩選，挑出陽性菌落，抽提重組質粒鑒定后測序；構建表達重組體pGEX-4T-1-CA-MA，轉化大腸桿菌BL21，經篩選后挑取菌落，抽提重組質粒鑒定后測序。根據CA-MA結構，尋找合適的突變位點，設計突變引物，利用反轉PCR定點突變技術，采用TaKaRa MutantBEST Kit對重組體pGEX-4T-1-CA-MA中CA-MA的第16位密碼子由AGT變?yōu)門GG。

3、將突變體轉化至大腸桿菌BL21中，挑出陽性菌落，抽提重組質粒鑒定后測序。將兩種陽性的重組轉化菌落用IPTG 37℃誘導表達， SDS-PAGE電泳觀察表達結果。抽提全菌體蛋白，用GSTrapFF親和層析柱純化得到GST-CA-MA和突變體GST-W16-CA-MA融合蛋白。 結果： 1、獲得優(yōu)化的CA-MA DNA片段，大小為66bp；構建了克隆重組體pUC-18-CA-MA，經酶切和DNA測序鑒定，結果表明與預先設計的

4、DNA序列完全一致。 2、CA-MA基因與表達載體連接，轉化至大腸桿菌BL21，抽提重組質粒，經酶切和DNA測序鑒定，結果表明表達重組體pGEX-4T-1-CA-MA構建成功，CA-MA基因與表達載體連接方向正確，可以進行誘導表達。 3、成功實現了對CA-MA基因的定點突變，獲得突變型表達重組體pGEX-4T-1-W16-CA-MA，轉化至大腸桿菌BL21中，測序結果表明CA-MADNA序列中第16位密碼子由AGT變?yōu)門

5、GG，達到預期突變結果。W16-CA-MA基因與表達載體連接方向正確，可以進行誘導表達。 4、兩種表達菌經IPTG誘導表達3～5h后，SDS-PAGE電泳結果可見約29KD的融合蛋白條帶，表達的融合蛋白經GSTrapFF親和層析柱純化后電泳，表明融合蛋白以包涵體形式存在。 結論：成功構建了表達重組體pGEX-4T-1-CA-MA及突變型表達重組體pGEX-4T-1-W16-CA-MA，并在大腸桿菌中誘導表達成功。初步得到