大腸桿菌耐熱性腸毒素STI串聯(lián)突變體融合基因的構(gòu)建及表達研究.pdf

1、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(簡稱ETEC)是引起仔豬腹瀉的主要病原之一。在家畜中，尤以初生幼畜易感，引起生長發(fā)育遲緩，生產(chǎn)能力低下，甚至造成死亡，給畜牧業(yè)造成極大損失。腸毒素和黏附素是ETEC的兩大致病因子，而耐熱性腸毒素STI又是腸毒素中最主要和最直接的致病因子。本研究利用PCR和基因定點突變技術構(gòu)建了4種含有STI突變體基因的重組表達質(zhì)粒pES(S)LK、pES(G)LK、pE3S(S)LK和pE3S(G)LK及相應的重組菌株，進行誘導培養(yǎng)

2、，通過乳鼠灌胃實驗檢測重組蛋白生物學毒性，并以重組蛋白為抗原建立了間接ELISA方法，對重組蛋白免疫抗體水平進行了檢測。本研究為有效防治仔豬大腸桿菌性腹瀉提供基礎材料和理論支持，為研制新的高效的大腸桿菌多價基因工程疫苗奠定了較為堅實的基礎。
　　 實驗結(jié)果如下：
　　 1.通過PCR和基因定點突變技術將STI毒素中心的6個Cys分別突變成Ser和Gly，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pES(S)LK、pES(G)LK及兩株基因工

3、程菌株BL21(DE3)(pES(S)LK)、BL21(DE3)(pES(G)LK):SDS-PAGE和Western blotting分析表明，兩種重組菌株所表達的ST I(S)-K99和ST I(G)-K99重組蛋白分別占菌體總蛋白相對含量的22.8％和30.9％，且能夠被產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌強毒株C83922抗血清特異性識別。利用乳鼠灌胃實驗檢測重組蛋白的生物學毒性，結(jié)果均為陰性(G/C值≤0.083)，表明重組菌株已無ST I生物

4、學毒性。
　　 2.通過PCR技術及基因重組技術，成功構(gòu)建了含有3個ST I突變體基因的重組表達質(zhì)粒pE3S(S)LK、pE3S(G)LK及其重組菌株BL21(DE3)(pE3S(S)LK)、BL21(DE3)(pE3S(G)LK)。SDS-PAGE和Western blotting分析表明，以上兩種重組菌株所表達的3ST I(S)-K99和3ST I(G)-K99重組蛋白，分別占菌體蛋白相對含量的21.4％和21.9％，且能夠

5、被產(chǎn)腸毒索性大腸桿菌強毒株C83922抗血清特異性識別。利用乳鼠灌胃實驗檢測重組蛋白的生物學毒性，結(jié)果均為陰性(G/C值≤0.083)，這表明該菌株已無ST I生物學毒性。
　　 3.對重組蛋白3ST I(S)-K99和3ST I(G)-K99進行了初步純化，作為抗原包被ELISA板，初步建立了一套檢測重組蛋白免疫抗體水平的間接ELISA方法。
　　 4.利用所建立的ELISA方法對重組蛋白免疫結(jié)果進行了檢測，發(fā)現(xiàn)以0.