TGM3和MAL基因在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中作用.pdf

1、第一部分
　　目的：為篩選和鑒定參與口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展相關的生物標志物，本課題組前期采用基因表達譜芯片，篩選發(fā)現(xiàn)Transglutaminase3(TGM3)基因在口腔鱗癌組織中表達顯著下調(diào)。本研究旨在驗證TGM3在口腔鱗癌中的表達水平；探討其表達下調(diào)的機制；分析TGM3對口腔鱗癌細胞增殖、克隆形成、凋亡和體內(nèi)成瘤等生物學特點的影響；分析TGM3表達水平與口腔鱗癌臨床病理、預后的關系。
　　方法：采用半定量RT-PCR、實時

2、定量RT-PCR和蛋白印跡技術，分別在9例口腔鱗癌細胞系和53對口腔鱗癌組織樣本中檢測TGM3的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平；使用DNA去甲基化藥物5-Aza-dC和組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA，處理口腔鱗癌細胞系后檢測TGM3表達水平變化，通過亞硫酸氫鹽測序分析口腔鱗癌細胞系以及口腔鱗癌組織樣本中TGM3基因啟動子區(qū)甲基化水平；在TGM3低表達的口腔鱗癌細胞中，過表達外源性TGM3后，分析其對口腔鱗癌細胞增殖、克隆形成、凋亡和裸鼠皮下成瘤能力的影響

3、；采用免疫組織化學技術檢測101例口腔鱗癌組織樣本中TGM3蛋白表達水平，分析其表達與口腔鱗癌臨床病理、預后的關系。
　　結果：TGM3的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平在口腔鱗癌細胞系及組織樣本中表達顯著下調(diào)；DNA去甲基化藥物5-Aza-dC可以劑量依賴性地上調(diào)TGM3的表達，亞硫酸氫鹽測序分析發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌細胞和組織樣本中TGM3基因啟動子區(qū)甲基化水平顯著高于正?？谇火つぜ毎团鋵Φ陌┲苷＝M織；表達外源性TGM3可以顯著抑制口腔鱗癌細胞的增

4、殖和克隆形成，能誘導凋亡并抑制口腔鱗癌細胞的裸鼠皮下成瘤能力；TGM3蛋白在口腔鱗癌組織中的表達與病理分化呈正相關(P=0.0037)；TGM3高表達的口腔鱗癌患者生存率顯著優(yōu)于TGM3低表達的口腔鱗癌患者(P=0.0002)；多因素Cox回歸分析顯示，TGM3的表達水平可以作為判斷口腔鱗癌患者預后的獨立指標(HR,0.286;95％CI,0.103-0.796;P=0.016)。
　　結論:DNA甲基化導致了TGM3基因在口腔鱗

5、癌中的表達下調(diào)；TGM3作為一個抑癌基因參與了口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展；TGM3可以作為判斷口腔鱗癌患者預后的候選生物標志物。
　　第二部分
　　目的：本課題組前期采用基因表達譜芯片篩選發(fā)現(xiàn)，Myelin and lymphocyte associated protein(MAL)基因在口腔鱗癌組織中表達顯著下調(diào)，通過體內(nèi)、外實驗證實，MAL基因作為抑癌基因影響口腔鱗癌細胞的增殖、克隆形成、凋亡、侵襲和裸鼠皮下成瘤能力。本研究旨

6、在通過構建MAL基因敲除鼠，在整體動物水平進一步研究MAL基因在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的功能和作用。
　　方法：通過基因打靶、同源重組技術構建MAL基因敲除鼠；采用PCR技術在DNA水平鑒定 MAL小鼠的基因型；通過胚胎發(fā)育、個體發(fā)育表型分析、血液生化指標分析、各組織器官組織病理學分析比較MAL純合子、雜合子和野生型小鼠可能存在的差異；采用不同劑量的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4-NQ

7、O)誘導MAL純合子、雜合子和野生型小鼠口腔黏膜成瘤，分析比較MAL純合子、雜合子和野生型小鼠在口腔黏膜病變發(fā)生率、發(fā)生時間、病變數(shù)量、病變進展速度和病變組織病理特征的差異。
　　結果：成功構建了MAL基因敲除鼠；完成了MAL基因敲除鼠的保種、繁殖、傳代；鑒定了新繁殖出的233只MAL小鼠的基因型；MAL純合子、雜合子和野生型小鼠在胚胎發(fā)育、個體發(fā)育、血常規(guī)、血液生化、各主要器官組織學結構未發(fā)現(xiàn)差異；暴露較小劑量4NQO（40μg

8、/ml）誘導下，MAL純合子小鼠發(fā)生口腔或食道黏膜的良性腫瘤或早期癌，而MAL雜合子、野生型小鼠經(jīng)相同劑量和時間4NQO誘導，僅發(fā)生口腔黏膜上皮異常增生；暴露較大劑量4NQO（80μg/ml）誘導下，發(fā)現(xiàn)MAL純合子小鼠發(fā)生口腔黏膜病變時間較雜合子、野生型小鼠發(fā)生口腔黏膜病變時間顯著提前，MAL純合子小鼠較雜合子、野生型小鼠口腔黏膜病變進展速度顯著增快，MAL純合子小鼠發(fā)生口腔黏膜病變數(shù)量較雜合子、野生型小鼠發(fā)生口腔黏膜病變數(shù)量顯著增多