Wnt2-β-catenin信號通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究.pdf

1、食管鱗癌是發(fā)展中國家尤其是我國最常見的惡性腫瘤之一,具有高復發(fā)率和低生存率的特征。雖然隨著各種治療措施的改進使其預后有了明顯提高,但截至目前為止,食管鱗癌在分子水平上的發(fā)生機制仍未徹底闡明。臨床前期和臨床期的諸多資料表明,食管鱗癌的早期發(fā)現(xiàn)對食管鱗癌患者的預后極其重要。從分子水平上闡述食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機制,將會有助于發(fā)現(xiàn)食管鱗癌治療的潛在靶點從而提高和改善食管癌患者的生存率和預后。
　　 編碼多功能糖蛋白的Wnt基因家族參與調(diào)

2、節(jié)人體各種病理生理過程,包括細胞分化、胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生。而作為Wnt/β-catenin信號通路樞紐分子的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)參與細胞內(nèi)兩個獨立的過程,即細胞粘附和Wnt信號轉(zhuǎn)導。正常情況下,大部分β-catenin與上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)粘附連接在胞膜上,只有極少部分存在于細胞質(zhì)中,胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平受蛋白降解復合體所調(diào)控,使β-catenin磷酸化從而被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解。然而一旦Wnt蛋白

3、與受體Frz結(jié)合,就可使胞質(zhì)內(nèi)散亂蛋白(Dsh)激活而被磷酸化,磷酸化的Dsh與APC結(jié)合抑制GSK3β活性,從而導致β-catenin不能被磷酸化。作為轉(zhuǎn)錄激活子的β-catenin從胞質(zhì)進入胞核與核內(nèi)TCF4/LEF1結(jié)合元件的啟動子區(qū)結(jié)合從而激活下游靶基因如c-my、cyclin D1、survivin、c-jun等的轉(zhuǎn)錄和表達。
　　 越來越多的證據(jù)表明,Wnt2/β-catenin信號通路的失調(diào)和紊亂與人類多種腫瘤發(fā)生

4、密切相關。目前有關Wnt2/β-catenin通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見詳細報道。而抑制β-catenin的藥物和單克隆抗體也已廣泛地應用于治療人類多種惡性腫瘤并取得了一定的效果。本研究中,β-catenin siRNA被用來抑制食管鱗癌細胞內(nèi)β-catenin的表達,觀察其對食管鱗癌細胞周期及細胞凋亡的影響,從而進一步闡述β-catenin在食管鱗癌癌變過程中可能的機制和作用。
　　 硝普鈉(SNP)作為一氧化氮(N

5、O)釋放劑,具有廣泛的生物學活性,參與調(diào)節(jié)機體多種生理活動。研究發(fā)現(xiàn),NO不僅參與與細胞增殖分化的調(diào)節(jié),而且還可促進細胞周期的捕獲和細胞凋亡。而作為心血管擴張劑應用于臨床的硝普鈉在腫瘤發(fā)生過程中與β-catenin之間潛在的抑制作用的機制仍有爭議。盡管炎性調(diào)節(jié)因子NO和激活的β-catenin之間關系的證據(jù)不斷增多,但在食管鱗癌中SNP誘導細胞凋亡是否通過降低β-catenin表達來實現(xiàn)尚未見報道。因此,本研究中我們同時觀察硝普鈉和β-

6、catenin siRNA對食管鱗癌Eca109和EC9706細胞細胞周期和細胞凋亡的影響。
　　 本研究通過檢測Wnt2及其下游靶基因在食管鱗癌組織中的表達情況,分析它們與腫瘤發(fā)生部位、組織學分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及五年生存率之間的關系;采用半定量RT-PCR和Western blots法檢測人食管鱗癌細胞中Wnt2及其下游靶基因mRNA和蛋白水平的表達情況。此外,利用新型CCK-8試劑盒檢測瞬時表達硝普鈉和β-caten

7、in siRNA對Eca109和EC9706細胞增殖的影響,通過半定量RT-PCR和Western blots檢測硝普鈉和β-catenin siRNA處理前后的食管鱗癌細胞株中與細胞周期調(diào)控有關的基因β-catenin、c-myc和cyclin D1表達水平的變化,進一步探討β-catenin siRNA作為潛在的腫瘤治療靶點的分子機理。最后利用流式細胞儀檢測硝普鈉和β-catenin siRNA處理前后對食管鱗癌細胞細胞周期以及細胞

8、凋亡的影響。
　　 總之,本研究探討了Wnt2/β-catenin信號通路在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用,有助于加深人們對食管鱗癌癌變分子機制的認識和了解,為利用β-catenin作為分子靶點的腫瘤基因治療提供了新的思路,對硝普鈉與Wnt2/β-catenin信號通路的相互作用關系的研究將為今后開發(fā)出更多選擇性強、高效低毒的靶向藥物提供了實驗依據(jù),并最終為分子水平治療食管鱗癌奠定了理論基礎。
　　 材料與方法
　　

9、1食管鱗癌Eca109及EC9706細胞中Wnt2/β-catenin信號通路激活狀態(tài)研究
　　 為了探討Wnt2/β-catenin通路在食管鱗癌Eca109及EC9706細胞中是否激活,我們采用細胞免疫化學法、RT-PCR和Western blots法檢測Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA及蛋白的表達水平。
　　 2人食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中Wnt2、β-cateni

10、n、c-myc和cyclinD1的表達情況
　　 40例食管鱗癌患者新鮮蠟塊標本取自于2001～2006年安陽市腫瘤醫(yī)院住院病人,所有患者手術(shù)前均未接受過放化療且手術(shù)標本均無壞死腫瘤組織,每份標本中均含癌組織,癌旁組織及正常組織。臨床及病理資料來自病人醫(yī)學檔案記錄。患者年齡45～74歲(中位年齡60.95歲),其中女性18人,男性22人。腫瘤組織呈高分化6例,中分化19例,低分化15例。手術(shù)切除標本經(jīng)10％甲醛固定,石蠟包埋,用

11、于免疫組織化學分析的標本被切成4μm厚切片,其中一張用于HE染色來確定其病理組織學類型,其余切片則用于免疫組織化學分析。
　　 首先將切片在二甲苯中脫蠟三次,每次5 min,然后置于梯度酒精中(梯度分別為100、90、80、70％)。為了加強抗原修復效果,切片放于微波爐中加熱10 min后放入盛有枸櫞酸鹽的緩沖液中,高壓修復20 min。為了阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,每張切片在3％H2O2的甲醇中室溫下放置30 min,PBS洗5

12、min×3次。切片和10％封閉用正常兔血清在室溫下孵育20 min,4℃放置過夜后再與1:100稀釋的一抗4℃過夜,然后加入生物素化二抗工作液,37℃濕盒內(nèi)孵育30min,最后加入辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液,37℃濕盒繼續(xù)孵育10 min,將DAB底物工作液滴加在切片上,顯微鏡下控制顯色,用自來水終止顯色反應并拍照。
　　 3不同濃度的硝普鈉作用Eca109及EC9706細胞后對Wnt2/β-catenin信號通路的影響

13、>　　 3.1細胞增殖實驗分析硝普鈉對食管鱗癌細胞增殖的影響
　　 采用CCK-8試劑盒檢測硝普鈉對食管鱗癌細胞增殖的影響。首先將不同濃度硝普鈉處理的Eca109及EC9706細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板,37℃培養(yǎng)24 h后每孔加入50μl用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度梯度硝普鈉混懸液,最后加入含10％CCK-8的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后用酶標儀測450 nm的吸光度。
　　 3.2實時熒光定量PCR檢測硝普

14、鈉對食管鱗癌細胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA的影響
　　 根據(jù)操作說明采用SYBR Green法進行PCR定量檢測。先用Trizol試劑提取細胞總RNA,然后采用AMV First Strand DNA Synthesis試劑盒合成cDNA第一鏈,PCR反應體系如下:0.5μl cDNA,0.5 U LA Taq DNA聚合酶,2.5μl10×LAPCR緩沖液,2.5 mM dNTP混

15、合物和各50 pM正向和反向引物,Actin作為對照。PCR反應條件為:預變性95℃5 min,然后95℃40 s,不同基因采用適宜的退火溫度退火40 s,72℃50 s,總共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。擴增結(jié)束后,取10μl樣品進行電泳檢測,并用Gene Tools進行mRNA相對表達量分析。
　　 3.3 Western blots分析硝普鈉對食管鱗癌細胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclinD

16、1蛋白的影響
　　 將不同濃度硝普鈉處理后的Eca109和EC9706細胞在裂解緩沖液中進行裂解,12,000 rpm/min離心5 min收集細胞裂解產(chǎn)物,蛋白濃度采用Bradford法進行測定。20μg總蛋白在1×SDS緩沖液中煮5 min,通過10％SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,硝酸纖維素膜先用含5％脫脂奶粉的PBST在室溫下封閉2 h,然后分別加入一抗(Wnt2、β-catenin、c-myc、cyclin

17、D1和β-actin)并用含1％脫脂奶粉的PBST進行稀釋,加入羊抗(或兔抗或鼠抗)連接辣根過氧化物酶的二抗,最后用DAB進行曝光顯影,并用Gene Tools進行蛋白相對表達量的分析。
　　 3.4硝普鈉對細胞周期的影響
　　 1×106個不同濃度硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細胞培養(yǎng)24 h后收獲并在PBS緩沖液中漂洗,然后在70％的冰乙醇中4℃固定30 min。冷PBS漂洗三次,細胞重懸于含40μg PI

18、和100μg RNaseA的PBS溶液中,37℃孵育30 min后通過流式細胞儀分析樣品中DNA的含量。
　　 3.5硝普鈉對細胞凋亡的影響
　　 將1 mM和2 mM硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細胞培養(yǎng)48 h用胰蛋白酶進行預處理,PBS漂洗后,加入5μl Annexin V-FITC和2.5μl PI至100μl的細胞懸液中,并在暗室中進行混勻和孵育15 min,最后把400μl結(jié)合緩沖液加入到混合物中進

19、行流式細胞分析。
　　 4β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞后對β-catenin信號通路的影響
　　 4.1半定量RT-PCR檢測β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后β-catenin、c-myc和cyclin D1mRNA的變化
　　 根據(jù)操作說明用Trizol試劑提取總RNA,然后用AMV First Strand DNASynthesis試劑盒合成cDNA第一鏈。PCR擴增的反應條件為:預變性

20、95℃5 min,然后95℃40 s,不同基因按適宜的退火溫度退火40 s,72℃50 s,總共35個循環(huán),最后在72℃延伸10 min。擴增后取10μl PCR產(chǎn)物進行電泳檢測,并用GoneTools進行相對表達量的分析。
　　 4.2 Western blots分析β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白的變化
　　 將β-catenin siRNA處理前后的食管鱗癌

21、細胞在裂解液中進行裂解。12,000rpm/min離心5 min后收集細胞裂解物,通過10％SDS-PAGE電泳電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,硝酸纖維素膜先用含有脫脂奶粉的PBST封閉,然后分別加一抗(Wnt2、β-catenin、C-myc、cyclin D1和β-actin),再加入鼠抗(羊抗或兔抗)連接的辣根過氧化物酶的二抗,最后用DAB進行顯影曝光。
　　 4.3β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對食管鱗癌細胞周期的影響

22、　　 1×106個β-catenin-siRNA處理后的Eca109及EC9706細胞培養(yǎng)24h后收獲,用0.2％胰蛋白酶消化,然后在70％的冰乙醇中4℃固定30 min后過夜。上機前用冷PBS漂洗三次,細胞重懸于含有40μgPI和100μg RNase A的PBS細胞懸液中,37℃孵育30 min后通過流式細胞儀檢測樣品中的DNA含量。
　　 4.4β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對食管鱗癌細胞凋亡的影響
　　 將

23、β-catenin siRNA處理后的Eca109及EC9706細胞培養(yǎng)48h后用胰蛋白酶進行處理,并用PBS進行漂洗,將終濃度1μg/ml Annexin V-FITC和250ng PI加入到含有細胞懸浮液和結(jié)合緩沖夜的混合物中,并在暗室中進行混勻和孵育15 min,然后取400μl的結(jié)合液加入到混合物中進行流式細胞檢測。
　　 5統(tǒng)計學分析
　　 RT-PCR和Western blots結(jié)果均采用Gene Tools

24、軟件進行灰度值分析,上述試驗均分別重復三次。統(tǒng)計學處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,進行單因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05表示差異具有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1 Wnt2/β-catenin信號通路在食管鱗癌組織和細胞中的異常激活
　　 細胞免疫化學結(jié)果表明,食管鱗癌Eca109和EC9706細胞中Wnt2和β-catenin均呈現(xiàn)陽性表

25、達。
　　 半定量RT-PCR分別擴增出Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA且人食管鱗癌EC9706細胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA的表達明顯高于Eca109細胞中的表達,二者在表達量上具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 Western blots法檢測食管鱗癌細胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1的表達情況,發(fā)

26、現(xiàn)食管鱗癌細胞株EC9706細胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表達明顯高于Eca109細胞,二者在表達量上具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2 Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白在食管鱗癌組織、癌旁組織和食管正常組織中的表達
　　 采用免疫組織化學法檢測40例人食管鱗癌組織、癌旁組織以及食管正常組織中Wnt2、β-catenin、c-myc和cycl

27、in D1的表達情況。結(jié)果顯示,Wnt2在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中陽性表達百分率依次為27.5％(11/40)、12.5％(5/40)和5.0％(2/40);β-catenin減弱的細胞膜表達在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中百分率依次為55.0％(22/40)、10.0％(4/40)和2.5％(1/40)；c-myc在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中陽性表達百分率依次為52.5％(21/40)、7.5％(3/

28、40)和2.5％(1/40);cyclin D1在食管鱗癌組織、癌旁組織及食管正常組織中陽性表達百分率依次為32.5％(13/40)、7.5％(3/40)和0％(0/40),且兩兩組相比差異均具有統(tǒng)計學意義。Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1在食管正常組織、癌旁組織及食管鱗癌組織中表達水平依次升高,即隨著食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1的異常表達率逐漸升高(P<0.

29、01)。
　　 β-catenin降低的膜表達和c-myc陽性表達明顯地與浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(P<0.05),而與腫瘤的分化程度及分期無相關性(P>0.05);Wnt2和cyclin D1的陽性表達率與腫瘤的分化程度及分期,浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無相關性(P>0.05)。
　　 具有β-catenin降低膜表達(P=0.031)和c-myc陽性表達(P=0.008)患者的五年生存率明顯降低提示預后較差,而Wnt

30、2及cyclin D1陽性及陰性表達患者的五年生存率之間則無統(tǒng)計學差異。
　　 3硝普鈉對Wnt2/β-catenin信號通路作用的相關分子機制研究
　　 3.1硝普鈉對人食管鱗癌Eca109和EC9706細胞增殖的影響
　　 用不同濃度硝普鈉處理Eca109及EC9706細胞后食管鱗癌細胞的生長增殖速率明顯減慢(P<0.05),而且在一定范圍內(nèi)抑制作用隨硝普鈉濃度增加而加強,結(jié)果表明,一定濃度的硝普鈉能抑制食管

31、鱗癌細胞的生長與增殖。
　　 3.2硝普鈉對Wnt2/β-catenin信號通路相關因子mRNA和蛋白表達的變化
　　 與硝普鈉處理前的Eca109及EC9706細胞相比,1 mM和2 mM硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細胞中的Wnt2和cyclinD1 mRNA的表達水平?jīng)]有明顯變化(P>0.05)。而同樣方式處理的細胞中β-catenin和c-myc mRNA的表達水平則明顯下調(diào)(P<0.05)。在三個獨立

32、的實驗中,與硝普鈉未處理組相比,1 mM和2 mM硝普鈉處理后的Eca109及EC9706細胞中的β-catenin和c-myc的蛋白表達水平均明顯下調(diào)(P<0.05),而同樣方式處理的Eca109及EC9706細胞中的Wnt2和cyclinD1的蛋白表達水平均沒有明顯改變(P>0.05)。
　　 3.3硝普鈉對食管鱗癌細胞周期和細胞凋亡的影響
　　 1 mM和2 mM硝普鈉作用Eca109和EC9706細胞后G0/G1

33、期的細胞百分數(shù)分別是72.4％、76.1％和76.4％、77.4％,與硝普鈉未處理組相比,2 mM硝普鈉作用于Eca109和EC9706細胞后S期的比率分別從16.6％上升到34.2％和從11.3％上升到12.8％,表明硝普鈉激活Wnt2/β-catenin信號通路導致DNA的合成受阻。不同濃度的硝普鈉作用食管鱗癌細胞后在C0/G1期細胞比率增加及在S期細胞比率降低提示硝普鈉能促進細胞周期捕獲。此外,1 mM和2 mM的硝普鈉作用食管鱗

34、癌Eca109和EC9706細胞后在Ⅱ期(早期凋亡期)的細胞百分數(shù)分別從7.86％上升至38.03％和從6.98％上升至26.55％。結(jié)果表明,硝普鈉能激活能誘導細胞發(fā)生凋亡。
　　 4β-catenin siRNA干擾食管鱗癌細胞后對β-catenin信號通路的影響
　　 4.1β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平的變化
　　 將β-ca

35、tenin siRNA分別轉(zhuǎn)染細胞0 h、24 h、48 h,β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染48h后的β-catenin mRNA水平達到最低；β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染24 h后cyclin D1mRNA水平開始逐漸下降,轉(zhuǎn)染48 h也達到最低。β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染前后c-myc基因的表達則無明顯影響。Western blots結(jié)果顯示β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染48 h后的β-catenin的蛋白水平

36、最低；β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染24 h后cyclin D1蛋白開始逐漸下降,轉(zhuǎn)染48 h后蛋白水平最低。β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染對c-myc蛋白的表達無影響。
　　 4.2β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后對細胞周期的影響
　　 轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA的Eca109細胞同未轉(zhuǎn)染組相比G0/C1期的細胞百分數(shù)從52.3％上升到66.5％且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),β-cateni

37、n siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合硝普鈉作用的Eca109細胞G0/G1期的百分數(shù)同轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA的Eca109細胞相比百分數(shù)從66.5％上升到68.2％且差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同樣地,轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA的EC9706細胞同未轉(zhuǎn)染組相比G0/G1期的百分數(shù)從57.1％上升到73.1％且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),β-cateninsiRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合硝普鈉作用的EC9706細胞G0/G1期的

38、百分數(shù)同轉(zhuǎn)染β-cateninsiRNA的Eca109細胞相比百分數(shù)從73.1％上升到77.8％且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示β-catenin siRNA聯(lián)合硝普鈉可能會對食管鱗癌細胞株的細胞周期進程具有協(xié)同抑制作用。
　　 4.3β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染后對細胞凋亡的影響
　　 β-catenin siRNA轉(zhuǎn)染Eca109和EC9706細胞與未轉(zhuǎn)染組相比在Ⅱ期的細胞百分數(shù)分別從1.40％提高至

39、16.88％和從0.71％提高至11.88％,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Wnt2和β-catenin在從食管正常組織、癌旁組織到食管鱗癌組織的發(fā)展過程中陽性表達率呈逐漸升高趨勢,其中在食管鱗癌組織中的陽性表達率最高。提示食管鱗癌中存在Wnt2/β-catenin信號通路的異常激活。
　　 2.β-catenin異常表達和c-myc陽性表達與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和五年生存率相關

40、(P<0.05),提示β-catenin和c-myc可作為判斷食管鱗癌患者預后的指標。
　　 3.硝普鈉能明顯地下調(diào)β-catenin和c-myc的表達且誘導食管鱗癌細胞周期阻滯和細胞凋亡,提示硝普鈉誘導細胞凋亡的作用可能是通過β-catenin/c-myc信號通路來實現(xiàn)的。
　　 4.β-catenin siRNA能特異性下調(diào)食管鱗癌細胞中β-catenin和cyclin D1的表達且能誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡,提示