IGF-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：體外分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法建立穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-IGF-1-BMSCs細(xì)胞株，并體外結(jié)合低血清培養(yǎng)基觀察向成骨分化的能力，為骨缺損的基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1：（1）采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)，并通過倒置顯微鏡及HE染色觀察細(xì)胞生長情況,CD44、CD90鑒定細(xì)胞表形；（2）抗壞血酸、地塞米松及β-甘油酸鈉聯(lián)合向成骨細(xì)胞分化，堿性磷

2、酸酶及茜素紅染色鑒定成骨活性；2：（1）真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1的擴(kuò)增純化及鑒定；（2）建立穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1-IGF-1-BMSCs細(xì)胞株，免疫熒光法、RT-PCR及Westernblot檢測IGF-1表達(dá)；（3）MTT法繪制基因轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞增殖曲線；（4）通過ELISA法、堿性磷酸酶及VonKossa染色后對真核質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1轉(zhuǎn)染后的兔BMSCs體外成骨活性進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果：1

3、、（1）兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀態(tài)良好，各代細(xì)胞形態(tài)基本一致；（2）抗壞血酸、地塞米松及β-甘油磷酸鈉誘導(dǎo)組BMSCsALP及鈣結(jié)節(jié)表達(dá)陽性；2、（1）真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1擴(kuò)增、純化成功；（2）成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)pcDNA-3.1-IGF-1-BMSCs細(xì)胞株；（3）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；（4）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IGF-1后細(xì)胞堿性磷酸酶分泌旺盛，Vonkossa染色后鏡下鈣結(jié)節(jié)計數(shù)轉(zhuǎn)染組顯著高于未轉(zhuǎn)染及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)