茵梔黃口服液對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥溶血及紅細(xì)胞膜ATP酶活性的影響.pdf

1、背景與目的：
　　茵梔黃口服液在治療新生兒高膽紅素血癥中起著非常重要的作用。G-6-PD酶活性缺乏癥是引起新生兒高膽紅素血癥的常見原因之一。然而，到目前為止，關(guān)于茵梔黃口服液能否會(huì)誘發(fā)或加重G-6-PD酶活性缺乏新生兒溶血性黃疸仍有爭(zhēng)議，其是否可以用于治療G-6-PD酶活性缺乏癥引起的黃疸尚不完全清楚。伯氨喹啉是一種常見的氧化型藥物，能引起G-6-PD酶活性下降患兒溶血，主要機(jī)制為G-6-PD酶活性下降時(shí)，紅細(xì)胞膜抗氧化能力下降，

2、易遭受氧化劑攻擊而損傷，同時(shí)，紅細(xì)胞膜受損后，ATP酶活性也隨之下降，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步損害。本研究通過(guò)建立G-6-PD酶活性下降大鼠動(dòng)物模型，檢測(cè)G-6-PD酶活性及溶血相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)觀察紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的變化，初步探討茵梔黃口服液是否會(huì)誘發(fā)或加重G-6-PD酶活性下降大鼠紅細(xì)胞溶血，為以后臨床是否可以安全應(yīng)用茵梔黃口服液治療G-6-PD酶活性缺乏癥所致的黃疸提供一定的理論

3、依據(jù)。
　　葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Glueose-6-phosphatedehydrogenase，G-6-PD)缺乏癥是引起新生兒高膽紅素血癥的常見原因之一。據(jù)報(bào)道其影響世界約3.3億人口，占全球人數(shù)的4.9％[5]。患者常在急、慢性感染、進(jìn)食蠶豆或接觸氧化性藥物等誘因下發(fā)病[6]。臨床特征主要表現(xiàn)為溶血性貧血和由此產(chǎn)生的高膽紅素血癥。高膽紅素血癥的主要并發(fā)癥是不可逆性膽紅素腦病，一旦發(fā)生膽紅素腦病，將嚴(yán)重影響患兒智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)

4、育，給家長(zhǎng)和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。但迄今為止，尚無(wú)有效的預(yù)防和治療辦法。
　　近年來(lái)，中藥治療新生兒高膽紅素血癥的報(bào)道屢見不鮮，其中茵桅黃口服液因其良好的藥效和無(wú)藥物不良反應(yīng)在治療新生兒高膽紅素血癥中起著非常重要的作用。茵梔黃口服液主要由茵陳、梔子、黃芩、金銀花等中藥經(jīng)提取、配制而成[7]。其中茵陳清利濕熱、利膽退黃，可以促進(jìn)膽汁酸及膽紅素的排泄，為治療黃疸之要藥。梔子與茵陳的結(jié)合，能增加膽汁排泄、促進(jìn)膽囊收縮、降低血液中

5、膽紅素水平[8]。黃芩清熱燥濕，具有抗氧化、保肝、利膽、消炎等作用。金銀花提取物具有廣譜抗菌、抗炎及解熱作用[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明全方具有抗病原微生物、抑菌、殺菌以及抑制機(jī)體變態(tài)反應(yīng)，從而減輕紅細(xì)胞溶血;通過(guò)促進(jìn)膽汁分泌及排泄、促進(jìn)腸蠕動(dòng)，因而有利于減少膽紅素的腸肝循環(huán)。臨床研究發(fā)現(xiàn)茵梔黃口服液對(duì)治療急慢性黃疸型肝炎、重癥、遷延性肝炎有明顯的功效，可能與降低膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶水平密切相關(guān)[10]。然而，關(guān)于茵梔黃口服液是否能安全應(yīng)用于G-

6、6-PD缺乏癥患兒仍存在爭(zhēng)議。然而茵梔黃口服液是否會(huì)誘發(fā)新生兒紅細(xì)胞溶血尚無(wú)明確臨床證據(jù)[11]。有研究報(bào)道:茵梔黃注射液對(duì)小兒蠶豆病已發(fā)生的溶血過(guò)程無(wú)影響，對(duì)G-6-PD酶的活性亦無(wú)影響。相反，其可顯著減輕黃疸的程度，縮短黃疸的發(fā)生時(shí)間，改善肝臟對(duì)膽紅素的等代謝[12]。我們的實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步從紅細(xì)胞膜ATP酶的角度探討茵梔黃口服液對(duì)G-6-PD活性下降動(dòng)物紅細(xì)胞膜有無(wú)損傷作用，從而推測(cè)茵梔黃口服液是否會(huì)誘發(fā)或加重G-6-PD酶活性下降大

7、鼠紅細(xì)胞溶血。
　　方法：
　　1.主要試劑與材料
　　1.1 藥品和試劑:茵梔黃口服液(北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司提供，批號(hào):z11020607)總膽紅素，直接膽紅素測(cè)試盒;超微量ATP酶測(cè)試盒;網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)液;均購(gòu)于南京建成生物工程研究所，伯氨喹啉原料藥;Tris-HCL氯化鎂（六水）;尿素;乙酰苯肼98％;;葡萄糖-6-磷酸二鈉; PMS; NADP氧化性輔酶Ⅱ;均購(gòu)自廣州金研生物科技有限公司。
　

8、　1.2 主要儀器:MD5多功能酶標(biāo)儀顯微鏡，日本Olympus公司;離心機(jī)thermo公司;冰箱，中國(guó)海爾;電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司;微量移液器，美國(guó)thermo公司。
　　1.3 選用Wistar遠(yuǎn)交系大鼠，雄性，體重(220±20)g。南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):NO.44002100000892;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào):NO.00056722。
　　2.方法
　　2.1 依

9、據(jù)文獻(xiàn)制作G-6-PD酶活性下降大鼠模型[1-2]，選用對(duì)紅細(xì)胞內(nèi)G-6-PD酶活性有干擾作用的強(qiáng)氧化劑乙酰苯肼(APH)為造模藥，復(fù)制G-6-PD酶缺陷(G-6-PD酶活性降低)大鼠模型，以1％ APH生理鹽水溶液1ml/100g體重給健康雄性大鼠作腹腔注射，每天上午1次，連續(xù)2d。在體給藥實(shí)驗(yàn)組于造模第2天下午灌胃給予觀察藥液（對(duì)照組給予同容積的生理鹽水）。
　　2.2 G-6-PD酶活性下降大鼠模型鑒定
　　樣品采集及

10、測(cè)定:第四天上午大鼠眼球后靜脈叢取血后。進(jìn)行G-6-PD酶活性測(cè)定抗凝血離心后收集紅細(xì)胞，采用四唑氮藍(lán)定量法(NBT)檢測(cè)G-6-PD酶活性。G-6-PD活性=反應(yīng)管吸光度s/空白對(duì)照管吸光度H*20.7NBT單位[3-4]。
　　2.3 分組及給藥:大鼠按體重隨機(jī)分6組，每組10只，即:正常組、實(shí)驗(yàn)組(模型組，伯氨喹啉陽(yáng)性對(duì)照組(伯氨喹啉0.015g/Kg)，茵梔黃口服液組大(2.5g提取物/Kg)、中（1.25g提取物/Kg）

11、、?。?.5g提取物/Kg）劑量組。）備注:（茵梔黃口服液，每毫升含原生藥提取物為0.166g，高劑量組動(dòng)物灌服原液，中劑量組將原液用水稀釋2.5倍后灌服，低劑量組將原液用水稀釋5倍后灌服）。每天下午三點(diǎn)準(zhǔn)時(shí)給藥，3天。
　　2.4 指標(biāo)檢測(cè):測(cè)定全血紅細(xì)胞數(shù)量和血漿游離血紅蛋白含量，按試劑盒說(shuō)明書操作步驟測(cè)定血清間接膽紅素含量，網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)液計(jì)數(shù)，超微量ATP酶測(cè)試盒測(cè)定紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-AT

12、P酶酶活性。
　　2.5 觀察不同處理組和不同給藥濃度對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)影響:用瑞氏染色法，在顯微鏡下觀察大鼠紅細(xì)胞形態(tài)。
　　2.6 觀察茵梔黃口服液體外對(duì)G-6-PD酶活性下降大鼠紅細(xì)胞滲透脆性的影響;體外給藥試驗(yàn)G-6-PD缺陷大鼠及正常大鼠眼球后靜脈取血，事先預(yù)備好不同濃度鹽水管，各管按計(jì)算需要分別加入等體積茵梔黃口服液，觀察紅細(xì)胞滲透脆性。
　　2.7 統(tǒng)計(jì)方法:采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)均記

13、作均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)的形式，應(yīng)用單因素方差分析比較多組間的差異，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性。
　　結(jié)果：
　　3.1 茵梔黃對(duì)G-6-PD酶活性下降大鼠G-6-PD酶活性的影響:
　　測(cè)定各組G-6-PD酶的活性（圖1），結(jié)果表明，與生理鹽水組相比，1％ APH溶液1ml/100g乙酰苯肼注射大鼠后第3天，G6-PD酶活性顯著降低;均在中重度缺乏程度，與模型組相比，茵梔黃中劑量組對(duì)大鼠G-6-PD酶活性明顯升

14、高（P＜0.01），大、小劑量組對(duì)大鼠G-6-PD酶活性無(wú)明顯影響;與伯氨喹啉組相比，茵梔黃各劑量組對(duì)大鼠G-6-PD酶活性均有升高趨勢(shì)，中劑量組更顯著。
　　3.2 茵梔黃對(duì)G-6-PD酶活性下降大鼠紅細(xì)胞溶血的影響:
　　與生理鹽水組相比，G-6-PD酶活性下降大鼠血漿游離血紅蛋白、外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清間接膽紅素含量均有升高(P＜0.01)。與模型組比較，茵梔黃大劑量組可以明顯升高血漿游離血紅蛋白、外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞

15、計(jì)數(shù)(P＜0.01)，血清間接膽紅素也有升高趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而茵梔黃中、小劑量組對(duì)游離血紅蛋白、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、間接膽紅素含量均沒(méi)有明顯影響;但均與伯氨喹啉組有顯著差異。
　　而氧化型藥物伯氨喹啉組明顯升高G-6-PD酶活性下降模型大鼠血游離血紅蛋白、外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)、血清間接膽紅素含量(P＜0.01)。
　　3.3 茵梔黃對(duì)G-6-PD酶活性下降大鼠紅細(xì)胞膜ATP酶活性的影響:與生理鹽水組相比，G-6-PD酶活性

16、下降大鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶均降低;而氧化型藥物伯氨喹啉更顯著(P＜0.01)。與模型組比較，茵梔黃中劑量可以明顯升高Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(P＜0.05)，對(duì)G-6-PD酶活性下降大鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性無(wú)明顯影響;茵梔黃大、小劑量組對(duì)G-6-PD酶活性下降大鼠紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP均無(wú)影響(P＞0.05)。與模型組比較，伯氨喹啉組可以

17、明顯降低Na+-K+-ATP酶活性(P＜0.05)，對(duì)Ca2+-Mg2+-ATP酶活性無(wú)明顯影響。
　　3.4 不同濃度茵梔黃口服液各組紅細(xì)胞形態(tài)比較（瑞氏染色*400倍）:
　　與生理鹽水組即G6-PD酶活性正常組相比，模型組，伯氨喹啉組，以及加入不同濃度茵梔黃口服液組，紅細(xì)胞形態(tài)均有改變。伯氨喹啉組紅細(xì)胞雙凹圓盤狀結(jié)構(gòu)減少，紅細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，皺縮數(shù)量減少增多。變形紅細(xì)胞及紅細(xì)胞碎片增加明顯。不同濃度茵梔黃各組中，中、小劑量