以軟骨細胞外基質為基礎構建組織工程軟骨以及骨軟骨復合體的實驗研究.pdf

1、研究背景：創(chuàng)傷、骨性關節(jié)炎等疾病引起的軟骨病變或骨軟骨聯(lián)合病變是骨科較為常見的疾患，同時由于關節(jié)軟骨自我修復能力有限，目前的多種治療方法，如微骨折術、自體或異體組織(骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊)移植等，存在種種缺陷從而限制了其臨床應用，并且不能獲得滿意的治療效果．應用組織工程技術構建組織工程軟骨或骨軟骨復合體被認為是目前最有可能解決此難題的技術手段。組織工程包括三大因素：種子細胞，支架材料和信號因子．骨髓基質干細胞(Bone marrow

2、mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，已經被證實能夠向骨、軟骨等多種組織分化；由于經過脫細胞處理去除了細胞抗原等免疫性物質而保留了大部分細胞外基質，來源于天然細胞外基質的支架材料，如人脫細胞真皮、脫細胞豬小腸黏膜下層、脫細胞豬心瓣膜以及脫細胞豬膀胱等，已經獲準臨床應用，目前雖然有關軟骨脫細胞處理的文獻報道，但研究水平僅停留在整塊脫細胞或者粉碎成軟骨微粒脫細胞的層面上，未見利用天然軟骨細胞外基質成功構

3、建出三維多孔網(wǎng)狀支架的報道。 本研究的目的是以天然軟骨細胞外基質材料為基礎，研制組織工程軟骨支架、組織工程骨軟骨雙層(雙相)支架，并探討其與骨髓基質干細胞復合構建組織工程軟骨以及骨軟骨復合體的可行性。在內容上主要包括：(1)利用軟骨細胞外基質材料制備軟骨組織工程用支架材料，并復合骨髓基質干細胞在體外以及裸鼠皮下異位構建組織工程軟骨；(2)利用軟骨細胞外基質和脫細胞骨基質制備組織工程用骨軟骨雙層(雙相)支架，并在體外構建組織工程骨

4、軟骨復合體；(3)利用骨髓基質干細胞復合骨軟骨雙層支架修復犬膝關節(jié)負重區(qū)骨軟骨聯(lián)合缺損，并對其結果進行大體、組織學、生物化學、生物力學、Micro-CT評估． 方法： (1)將天然人軟骨粉碎，取500nm～5μm軟骨微絲，經脫細胞處理后制備為軟骨細胞外基質微絲懸液，冷凍凍干法制備得三維多孔支架，采用物理/化學方法交聯(lián)，得到軟骨細胞外基質來源的三維多孔支架(CartilageECM-derived3-D Porous Sc

5、affold，CEDPS)，對支架材料進行組織學、生化成分定量分析以及理化性能檢測．分離培養(yǎng)犬骨髓基質干細胞，評價支架生物相容性和細胞毒性。 (2)將軟骨細胞外基質微絲與殼聚糖復合，構建出三維多孔組織工程支架，并對其理化性能進行評估。 (3)骨髓基質干細胞經含10ng/ml TGF-β1，10ng/ml bFGF，10-7M地塞米松的條件培養(yǎng)基成軟骨誘導后，種植到CEDPS支架上，掃描電鏡觀察細胞黏附情況，Dead/Li

6、ve免疫熒光染色觀察支架內部細胞活性，體外培養(yǎng)1，3周后觀察大體形態(tài)和組織學形態(tài)變化，同時行Ⅱ型膠原免疫組織化學分析。 (4)BMSCs成軟骨誘導后，用PKH26熒光染料標記，構建BMSCs-CEDPS支架復合體，體外培養(yǎng)3d后，植入裸鼠背部皮下，利用分子熒光活體成像系統(tǒng)無創(chuàng)傷性評估組織工程化組織在裸鼠體內生長情況，4周后取材，進行組織學檢測以及Ⅱ型膠原免疫組織化學與免疫熒光分析。 (5)用新型脫細胞方法制備脫細胞骨基質

7、(AcellularBone Matrix，ACBM)，評估其理化特性與生物相容性。 (6)分別用軟骨細胞外基質與脫細胞骨以及PLGA與脫細胞骨構建兩種組織工程骨軟骨雙層支架：CEDPS/ACBM，PLGA/ACBM，評估其理化性能。 (7)利用BMSCs與CEDPS/ACBM雙層支架體外構建組織工程骨軟骨復合體，并進行大體、電鏡、組織學觀察。 (8)在犬膝關節(jié)內外髁高負重區(qū)造一直徑4.2mm，深6mm的骨軟骨缺損，

8、分為誘導BMSCs-CEDPS組(實驗組)和單純CEDPS支架組(對照組)，分別在3，6月取材，從大體，組織學，生物化學及生物力學，Micro-CT等方面進行全面評估。 結果： (1)組織學顯示CEDPS支架中無軟骨細胞碎片殘留，甲苯胺藍染色、蕃紅花“0”、Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈陽性；生化定量結果表明支架保留了大部分的細胞外基質成分；Micro-CT與掃描電鏡結果顯示支架內孔洞相互連通似海綿狀，具有良好的孔徑和孔隙率

9、；理化性能結果顯示支架具有良好的吸水性能，支架的縱向彈性模量與軟骨一個數(shù)量級，并且具有良好的拉伸性能．倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察顯示細胞在支架上生長良好，細胞毒性實驗表明支架對細胞的生長、增殖無影響． (2)軟骨細胞外基質與殼聚糖復合支架具有良好的孔徑、孔隙率和吸水性，生物力學結果表明復合支架的彈性模量與軟骨同一數(shù)量級． (3)體外培養(yǎng)的BMSCs-CEDPS復合體形成了類軟骨樣組織，Dead/Live染色表明支架內部均為

10、活細胞，組織學結果表明蕃紅花“0”、Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，電鏡和組織學結果表明隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞在支架中增殖顯著，細胞外有大量基質分泌． (4)經誘導的BMSCs與CEDPS支架在裸鼠皮下成功構建了類軟骨組織，PKH26熒光示蹤以及分子熒光活體成像系統(tǒng)能無創(chuàng)傷評估組織工程化軟骨在裸鼠體內的生長情況，結果表明構建的類軟骨組織中的細胞來源于接種的BMSCs． (5)新方法制備的脫細胞骨基質材料去細胞徹底，具備良好的

11、微觀結構，與同部位的新鮮骨塊具有相似的生物力學性能。 (6)制備的兩種組織工程骨軟骨雙層(雙相)支架：CEDPS/ACBM，PLGA/ACBM，均具有良好的孔徑和孔隙率，并且支架的骨、軟骨部分結合良好． (7)體外培養(yǎng)的BMSCs與CEDPS/ACBM雙層支架復合體，組織學結果表明軟骨部分蕃紅花“0”、Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性，骨軟骨層結合良好。 (8)在修復犬膝關節(jié)骨軟骨缺損的實驗中，結果顯示兩組以纖維軟骨或透

12、明軟骨對缺損有不同的修復，大體以及組織學評分表明實驗組明顯優(yōu)于對照組，生物力學測試表明6月實驗組修復軟骨的剛度為正常膝關節(jié)軟骨的70.1％，與生物化學分析結果一致；軟骨下骨的剛度達到正常膝關節(jié)的74.96％。Micro-CT結果表明實驗組與對照組軟骨下骨重建不具備明顯差異． 結論： (1)以天然軟骨細胞外基質為材料構建的三維多孔海綿支架，去細胞徹底，保留了軟骨細胞外基質的主要成分，具備合適的孔徑、孔隙率、吸水性能、生物力

13、學性能以及良好的生物相容性，無細胞毒性，可作為軟骨組織工程的支架載體． (2)軟骨細胞外基質與殼聚糖復合支架具有良好的孔徑、孔隙率、吸水性、生物力學性能，可作為軟骨組織工程支架載體的良好選擇。 (3) CEDPS能為BMSCs成軟骨方向誘導分化提供理想的三維立體環(huán)境，BMSCs與CEDPS復合能在體外構建類軟骨樣組織． (4)PKH26熒光示蹤與分子熒光活體成像系統(tǒng)結合，能夠無創(chuàng)傷性評估組織工程化組織的種子細胞在

14、動物體內生長情況與轉歸． (5)利用BMSCs和CEDPS支架能夠在裸鼠皮下異位構建類軟骨樣組織。 (6)新方法制備的脫細胞骨基質材料去細胞徹底，具備良好的微觀結構，合適的生物力學性能，可作為骨組織工程支架載體的良好選擇。 (7)制備的兩種組織工程骨軟骨雙層支架：CEDPS/ACBM，PLGA/ACBM，兩層結構分別適合骨、軟骨生長的不同要求，并且層間結合緊密，可作為構建組織工程骨軟骨復合體的支架載體的良好選擇。