人臍帶間充質干細胞復合軟骨細胞外基質支架修復兔膝關節(jié)軟骨缺損.pdf

1、實驗目的:評價人臍帶間充質干細胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)作為軟骨組織工程種子細胞的可行性。主要包括四部分內容:(一)鑒定hUCMSCs的生物學特性,體外構建hUCMSCs/軟骨細胞外基質支架復合體,并植入裸大鼠背部皮下異位構建組織工程軟骨;(二)hUCMSCs復合在纖維蛋白凝膠(fibringel,FG)中修復裸大鼠關節(jié)軟骨缺損的初步研究;(三)hUCMSCs/軟骨

2、細胞外基質支架復合體異種移植修復兔膝關節(jié)軟骨缺損的實驗研究;(四)制備可雙相釋放兩種生長因子的軟骨組織工程取向支架。
　　實驗方法:(1)選取第4代hUCMSCs進行體外成軟骨、成骨、成脂肪誘導,流式細胞術檢測細胞表面標志,與軟骨細胞外基質支架復合體外構建組織工程軟骨,體外成軟骨誘導2周后植入裸大鼠背部皮下異位成軟骨,4周后取材進行大體觀察及組織學分析。(2)hUCMSCs復合在纖維蛋白凝膠中,體外成軟骨誘導2周后,行Dead/L

3、ive染色檢測細胞活性,植入裸大鼠股骨滑車遠端直徑2.0mm,深1.0mm的軟骨缺損,4周后取材行大體觀察及組織學分析。(3)在新西蘭大白兔股骨滑車遠端做直徑4.0mm,深1.0mm的全層關節(jié)軟骨缺損,分別植入單純支架、未誘導hUCMSCs/軟骨細胞外基質支架復合體、誘導的hUCMSCs/軟骨細胞外基質支架復合體以及缺損曠置組。分別在植入術后3、6、12、16個月取材,對修復組織進行大體觀察、組織學分析及生物化學檢測,并按照ICRS(I

4、nternationalCartilageRepairSociety)大體評分及MODS(ModifiedO’DriscollScore)組織學評分標準對修復組織進行定量評價。(4)利用W/O/W的雙乳化溶劑揮發(fā)技術制備負載胰島素樣生長因子(IGF-1)的PLGA微球,與軟骨細胞外基質材料混勻,通過熱誘導的相分離技術(thermal-inducedphaseseparation,TIPS)制備成組織工程軟骨取向支架。利用等離子體處理技術

5、(plasmatreatment)將TGF-β1錨定在支架表面上。
　　實驗結果:(1)hUCMSCs為成纖維樣細胞形態(tài),貼壁生長;體外成骨誘導后茜素紅染色陽性,成軟骨誘導后番紅花O染色及Ⅱ型膠原染色陽性,成脂肪誘導后油紅O染色陽性;流式細胞術檢測表明hUCMSCs陽性表達CD105、CD90、CD73、CD44、HLA-ABC,陰性表達CD34、CD45、HLA-DPDQDR;hUCMSCs復合軟骨細胞外基質支架,無論誘導組還是

6、未誘導組都能在裸大鼠背部皮下形成類軟骨組織,未誘導組甲苯胺藍染色及番紅O染色呈弱陽性,而誘導組呈強陽性。(2)hUCMSCs復合在纖維蛋白凝膠中,無論誘導組還是未誘導組都能在裸大鼠關節(jié)軟骨缺損處生成軟骨組織。(3)hUCMSCs復合軟骨細胞外基質支架修復兔膝關節(jié)軟骨缺損,在植入術后3、6、12、16月4個時間點,未誘導組的修復組織ICRS評分及MODS評分都顯著高于誘導組;在未誘導組及誘導組,術后6個月ICRS評分及MODS評分達到最高

7、,12個月及16個月評分逐漸降低;術后6個月時未誘導組GAG含量顯著高于誘導組。(4)制備的負載胰島素樣生長因子(IGF-1)的PLGA微球,激光共聚焦顯微鏡顯示微球內部呈中空多囊腔結構;免疫熒光檢查顯示兩種生長因子都成功負載在支架上;體外緩釋研究顯示2種生長因子都能緩釋30天以上。
　　結論:(1)hUCMSCs屬于間充質干細胞,具備異位成軟骨能力,體外誘導有利于體內軟骨基質形成。(2)hUCMSCs復合在纖維蛋白凝膠中能在在裸

8、大鼠軟骨缺損區(qū)生成軟骨組織。(3)hUCMSCs復合軟骨細胞外基質支架能夠修復兔關節(jié)軟骨缺損;未誘導的hUCMSCs修復效果優(yōu)于體外成軟骨誘導的hUCMSCs;體內產生的修復組織16個月后出現不同程度的退變。(4)用W/O/W的雙乳化溶劑揮發(fā)技術(doubleemulsionsolventevaporation)成功制備出包載胰島素樣生長因子的微球;利用微球包載及等離子體處理錨定技術成功制備出能雙相釋放兩種生長因子的軟骨細胞外基質取向支