神經(jīng)營養(yǎng)因子3對神經(jīng)干細胞移植治療腦外傷保護作用的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷是神經(jīng)外科的常見病和多發(fā)病，國內外神經(jīng)外科醫(yī)師一直致力于重型顱腦損傷的臨床治療和相關的基礎研究。神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞。過去認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)損傷后神經(jīng)元或軸突不能再生。近年來研究證實中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在著具有多分化潛能和自我更新能力的NSCs，它們在一定的條件下能夠進行增殖以及向特定的方向進行

2、誘導分化；神經(jīng)元軸突具有再生潛力并能形成新的突觸聯(lián)系，這使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的NSCs的替代治療成為可能。雖然NSCs終身存在，但其絕對數(shù)量和受局部微環(huán)境所限，致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或變性時，自我修復作用微乎其微。近年來，對神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin-3，NT-3)的研究發(fā)現(xiàn)，NT-3對NSCs具有促進其分化為神經(jīng)元和膠質細胞的作用。另外，由于NSCs進行活體移植后，較長時間的存活和分化有一定的困難，研究發(fā)現(xiàn)

3、可能與微環(huán)境的營養(yǎng)因子缺乏有關。為此，我們主要就NSCs移植后加入NT-3，觀察NT-3對NSCs移植治療腦外傷的作用。 1建立SD大鼠胚胎端腦皮層NSCs的分離、培養(yǎng)、增殖、分化與鑒定技術觀察NSCs的生長、增殖及分化特點。分離SD大鼠胚胎端腦皮質，經(jīng)酶消化及機械吹打后，用懸浮培養(yǎng)的方法，獲得細胞克?。挥糜邢尴♂尫ㄟM行單克隆培養(yǎng)，得到來源于同一細胞的亞細胞系克??；用免疫細胞化學方法，鑒定NSCs。從SD大鼠胚胎端腦皮質分離的細

4、胞，經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)均可形成細胞克隆，并具有增殖能力：免疫細胞化學Nestin抗體染色陽性；單細胞克隆能分化成神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。用此方法分離的細胞具有自我更新和分化潛能、有很強的增殖能力，是屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞。 2建立SD胚胎大鼠端腦皮層NSCs的冷凍復蘇方法，觀察凍存復蘇后NSCs的活力及生物學特性。采用10％BSA+10％DMSO作冷凍保護劑，于超低溫冰箱(-150℃)中凍存；采用細胞培養(yǎng)和免疫細胞化

5、學方法觀察凍存復蘇后細胞的活力、形態(tài)、分化能力及特異性抗原表達。不同的凍存時間、細胞代數(shù)對凍存后細胞的存活率沒有明顯影響；凍存復蘇的NSCs不僅有較高的存活率，而且仍保持其原有的生物學特性。胚胎大鼠端腦皮層NSCs的短期凍存并不影響其活力及原有的生物學特性，可作為NSCs保存的一種較好途徑。 3研究NT-3對SD胚胎大鼠端腦皮層NSCs分化的影響。在NSCs培養(yǎng)液中分別加入NT-31ng/ml，5ng/ml和1ong/ml三個不

6、同劑量組，在CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察NSCs的生長分化情況。含有NT-3的培養(yǎng)液NSCs主要分化為神經(jīng)元和少突膠質細胞，可分化為少量的星形膠質細胞，分別行NSE，GalC和GFAP染色為陽性。NT-3主要促進NSCs分化為神經(jīng)元和少突膠質細胞，也可以分化為少量的星形膠質細胞。 4主要觀察研究腦外傷后移植NSCs的治療作用以及同時給予NT-3，觀察NSCs在體內的存活、分化、遷移情況。SD胚胎大鼠端腦皮層NSCs的體外培

7、養(yǎng)以及BrdU的轉染；腦外傷模型的建立；NSCs移植給腦外傷大鼠，同時NT-3試驗組給予NT-31ng/ml，5ng/ml和1ong/ml，分別在1，2，3周后對大鼠進行神經(jīng)功能行為學評分，然后處死動物，進行流式細胞學檢查，以及HE染色、Nestin、GFAP、NSE、GalC、BrdU等免疫細胞化學染色和Tunel原位雜交染色。在1，2，3周時神經(jīng)功能行為學評分NSCs組和NT-3組均明顯比對照組得分低，統(tǒng)計學處理有差異；Nestin

8、、GFAP、NSE、GalC、BrdU抗體染色結果，NSCs組和NT-3組均明顯比對照組陽性率要高，統(tǒng)計學處理有差異；而Tunel染色則對照組明顯比NSCs組和NT-3組高，有統(tǒng)計學差異；流式細胞學檢測結果對照組發(fā)生凋亡的細胞數(shù)也明顯比NSCs組和NT-3組高；NSCs組與NT-31ng/ml，5ng/ml和1ong/ml劑量組比較，Nestin、GFAP、NSE、GalC、BrdU抗體染色陽性率要偏低，而Tunel染色和流式細胞學檢測

9、發(fā)生凋亡的細胞數(shù)要偏高，均有統(tǒng)計學差異，而且NT-31ong/ml劑量組的差異更明顯。腦外傷后移植NSCs后神經(jīng)干細胞可以在損傷區(qū)存活、增殖及分化，并且在損傷的遠隔部位有少許NSCs遷移和分化。NT-3對NSCs的移植存活、增殖與分化均有明顯的促進作用，而且主要使NSCs朝神經(jīng)元和少突膠質細胞的方向分化，尤其以NT-31ong/ml劑量組作用最明顯。 結論1成功分離，培養(yǎng)的細胞具有自我更新和分化潛能，行免疫細胞化學Nestin、

10、NSE、GFAP和GalC抗體染色為陽性，為SD大鼠胚胎端腦皮層NSCs。2對培養(yǎng)的不同代的SD大鼠胚胎端腦皮層NSCs進行凍存，在不同的凍存時間進行復蘇后，細胞的活力和生物學特性沒有明顯改變。3NT-3的1ng/ml,5ng/ml，1ong/ml三個劑量組均能夠使NSCs發(fā)生分化，其中分化為神經(jīng)元和少突膠質細胞的數(shù)量較多，而朝星形膠質細胞分化的相對較少，尤其以1ong/ml的作用最為明顯。4NSCs早期移植給受損傷的腦組織，NSCs在