腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植大鼠創(chuàng)傷性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic Brain Injury,TBI)是指由外傷引起的腦組織損傷。致殘率高、死亡率高,是兒童和青少年致殘的主要原因之一。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,對(duì)TBI的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。然而,臨床上治療TBI失敗的主要原因可能是由原發(fā)損傷引起的繼發(fā)損傷,包括炎性反應(yīng)、血腦屏障破壞和一系列的細(xì)胞因子釋放等。目前,治療嚴(yán)重的腦損傷即使挽救了生命,但因?yàn)橐呀?jīng)壞死的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)法再生恢復(fù),因此仍缺乏有效的治療措施

2、來(lái)恢復(fù)患者由損傷引起的各種功能缺陷,給家庭與社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。
　　 神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)或神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitorcells,NPCs)的特征和成功分離培養(yǎng)使直接移植這些細(xì)胞治療腦損傷成為可能。研究表明,在發(fā)育期胚胎和成年哺乳類(lèi)動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著具有多向分化潛能的NSCs。實(shí)驗(yàn)研究證明,NSCs移植中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病后可以在一定時(shí)間內(nèi)存活

3、,并且分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)NSCs移植替代治療可能實(shí)現(xiàn)修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的組織損傷并部分恢復(fù)由損傷引起的功能缺陷。然而,中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Neural System,CNS)外源性損傷引起的局部生物化學(xué)改變及神經(jīng)細(xì)胞相對(duì)較弱的再生能力限制了移植NSCs的存活和分化。如何有效地解決構(gòu)建NSCs自我更新、有序增殖與定向分化為神經(jīng)元所賴(lài)生存的微小環(huán)境,提高移植后細(xì)胞長(zhǎng)期存活及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立,成為目前研究腦損

4、傷NSCs代替治療的熱點(diǎn)。NSCs除了神經(jīng)替代作用外,很多學(xué)者還把NSCs作為理想的靶細(xì)胞,用于體外轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因修飾,然后對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)行體內(nèi)移植治療。
　　 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF),是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族的重要成員,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的發(fā)育、存活、分化和軸突再生中發(fā)揮著重要作用。以前的研究表明,BDNF直接注入脊索損傷紅核附近能夠防止和逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細(xì)胞萎縮

5、,促進(jìn)軸突再生,但此種給藥途徑限制了給藥量,并且反復(fù)給藥容易引起炎癥和局部組織損傷。近年來(lái),基因治療得到了廣泛研究?；蛑委熓菍⒄；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用,從而達(dá)到治療疾病的生物醫(yī)學(xué)技術(shù)。基因治療為應(yīng)用BDNF治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病帶來(lái)新的曙光。
　　 因此,本研究應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將BDNF導(dǎo)入NSCs,采用PKH26熒光示蹤劑分別標(biāo)記這些細(xì)胞和天然的NSCs,并移植入TBI大

6、鼠腦內(nèi)。我們追蹤觀察了BDNF對(duì)NSCs的存活和分化的影響,并通過(guò)對(duì)損傷腦組織中突觸蛋白的檢測(cè)探討了其促進(jìn)功能恢復(fù)的可能機(jī)制。
　　 方法：從E14大鼠胚胎分離NSCs,進(jìn)行原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng);用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)NSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化;采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)對(duì)培養(yǎng)的NSCs和其分化為神經(jīng)元的表型進(jìn)行鑒定。采用改良的Feeney法制各創(chuàng)傷性腦損傷模型。PKH26熒光示蹤劑標(biāo)記NSCs,利用腦立體定位儀和微量注射泵進(jìn)行NSCs

7、腦內(nèi)移植,應(yīng)用熒光顯微鏡觀察移植細(xì)胞的存活、分布和分化為βⅢ-微管蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元的表型。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA-BDNF,采用非脂質(zhì)體的脂類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染NSCs,應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)、激光共聚焦掃描顯微鏡和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞BDNF和Nestin的表達(dá)和共存。分別將BDNF轉(zhuǎn)染的NSCs(BDNF/NSCs)和天然NSCs移植于TBI動(dòng)物腦內(nèi),采用gridwalk和latency試驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物的神經(jīng)行為學(xué)改變;觀察BDNF對(duì)NS

8、Cs存活和分化的影響;采用免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)在不同移植組、移植后不同時(shí)間點(diǎn)腦組織損傷區(qū)BDNF、突觸素(synaptophysin,SYP)和突觸后蛋白(Shank2)mRNA和蛋白表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 1、在培養(yǎng)基中,NSCs呈球團(tuán)狀懸浮生長(zhǎng),Nestin表達(dá)陽(yáng)性。用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基對(duì)NSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化,發(fā)現(xiàn)分化后第2天,多數(shù)細(xì)胞伸出突起,以后突起逐漸延長(zhǎng),分

9、支增加。分化后第5d,部分細(xì)胞呈βⅢ-微管蛋白陽(yáng)性。
　　 2、PKH26標(biāo)記的NSCs移植于腦內(nèi)第8w,PKH26熒光強(qiáng)度未見(jiàn)明顯減弱。第8w,細(xì)胞存活數(shù)量為4.1％±0.9％。在移植后第2w,一些細(xì)胞廣泛遷移至移植核心以外區(qū)域。NSCs于移植后第1、2、4和8w分化為βⅢ-微管蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞的比例分別為4.3％±1.9％,8.1％±2.8％,13.6％±2.0％,11.4％±1.6％。
　　 3、克隆測(cè)序結(jié)果顯示

10、,重組質(zhì)粒與參考序列完成一致,pcDNA3.1-BDNF質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)749bp和5.4kb兩個(gè)條帶,其大小分別與載體pcDNA3.1和BDNF cDNA一致。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)藥物篩選后第10d,免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示部分細(xì)胞呈Nestin及BDNF雙重陽(yáng)性,RT-PCR檢測(cè)可見(jiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BDNF呈高表達(dá)。
　　 4、與NSCs移植組比較,在移植后第1w,BDNF/NSCs移植組大鼠通過(guò)平板的移動(dòng)

11、時(shí)間明顯縮短(p＜0.05)。Gridwalk試驗(yàn)中,在移植后第1w,BDNF/NSCs移植組前、后肢不對(duì)稱(chēng)分值均明顯低于NSCs移植組(p＜0.05).在第2w,兩組間后肢的不對(duì)稱(chēng)分值也有顯著性差異(p＜0.05),但此時(shí)BDNF/NSCs移植組的后肢表現(xiàn)已經(jīng)恢復(fù)至基線水平。
　　 5、在移植后的不同時(shí)間點(diǎn),與NSCs移植組比較,BDNF/NSCs組的移植細(xì)胞存活數(shù)和分化為神經(jīng)元的比例均明顯增加(p＜0.05)。
　　

12、 6、RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在移植后第1、2w,BDNF/NSCs移植組損傷灶及周?chē)X組織中的BDNF呈高表達(dá)。
　　 7、在移植后第1、2w,BDNF/NSCs移植組損傷灶及周?chē)M織中的SYP和Shank2的基因和蛋白表達(dá)均高于NSCs移植組(p＜0.05),第4、8w,Shank2的基因和蛋白表達(dá)也高于NSCs組(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、PKH26標(biāo)記NSCs,準(zhǔn)確性高、標(biāo)記率高、方法簡(jiǎn)便、

13、未見(jiàn)明顯毒性,PKH26標(biāo)記的NSCs移植于TBI大鼠損害區(qū),移植后第8w,PKH26熒光強(qiáng)度未見(jiàn)明顯減弱,能夠很好的示蹤觀察移植細(xì)胞的存活、遷移和分化。提示PKH26可以作為一種有效的體內(nèi)示蹤劑對(duì)NSCs移植治療TBI進(jìn)行示蹤觀察。
　　 2、外源基因BDNF通過(guò)非脂質(zhì)體的脂類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染NSCs,在一定時(shí)間內(nèi),可以使NSCs持續(xù)、穩(wěn)定地表達(dá)BDNF。
　　 3、BDNF/NSCs移植促進(jìn)了TBI動(dòng)物的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)