甘藍型油菜BnWRKY28轉(zhuǎn)錄因子功能分析.pdf

1、油菜是我國重要的經(jīng)濟作物之一，但是在實際生產(chǎn)過程中，往往會遭受到各種生物和非生物脅迫，嚴重影響油菜的產(chǎn)量。
　　在長期的進化過程中，植物形成了復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)來抵御各種逆境脅迫，而轉(zhuǎn)錄因子在這個過程中起到了十分重要的作用。植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子是重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，WRKY蛋白得名于其N-端含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK及其特殊的鋅指結(jié)構(gòu)，它通過特異性識別并結(jié)合下游基因啟動子區(qū)的(T)(T)TGAC(C/

2、T)序列(W-box)，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制下游基因表達的調(diào)控作用。近年來有關(guān)植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能研究越來越多，其成員也廣泛參與了植物的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控進程，如生長發(fā)育、對生物或非生物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)以及物質(zhì)代謝等。有些WRKY轉(zhuǎn)錄因子也表現(xiàn)出多效性，同時在植物生物進程的多個方面起到調(diào)控作用，從而起到協(xié)調(diào)植物生長發(fā)育和應(yīng)對外界環(huán)境之間平衡的作用。
　　本研究以甘藍型油菜寧RS-1和Westar為實驗材料，從甘藍型油菜寧RS-1中

3、克隆得到來自Ⅱ-c亞族的Bn WRKY28基因cDNA序列，通過序列分析、誘導(dǎo)表達模式分析、亞細胞定位分析、過表達植株表型分析、激素處理、qRT-PCR、抗逆鑒定、內(nèi)源激素測定等方法初步探討了該BnWRKY28基因的相關(guān)生物功能，主要的研究結(jié)果如下:
　　1 BnWRKY28基因的克隆
　　利用同源克隆法克隆到甘藍型油菜中一個Bn WRKY28基因，該基因cDAN序列包括939bp的開放閱讀框，編碼一個含313個氨基酸的多肽

4、，預(yù)測分子量為34.973kDa，理論等電點為6.67。利用PlantCARE和PLACE軟件對該基因啟動子區(qū)1kb序列進行預(yù)測，得到一系列與生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，說明Bn WRKY28基因可能參與這些信號通路的調(diào)節(jié)。
　　2亞細胞定位與轉(zhuǎn)錄激活活性分析
　　將BnWRKY28基因融合GFP信號轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體進行亞細胞定位，顯示BnWRKY28特異性的定位于細胞核中，具備轉(zhuǎn)錄因子的一般特性。在酵母中進行轉(zhuǎn)

5、錄激活活性分析，顯示BnWRKY28具有轉(zhuǎn)錄激活的活性。
　　3誘導(dǎo)表達模式分析
　　利用qPCR分析BnWRKY28在甘藍型油菜Westar中的表達模式顯示，BnWRKY28受到信號分子水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)以及腐生型真菌核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）誘導(dǎo)都上調(diào)表達，暗示BnWRKY28可能參與多種信號通路。
　　4油菜遺傳轉(zhuǎn)化及Bn WRKY28過表達株表型分析
　

6、　利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化油菜下胚軸，通過組織培養(yǎng)得到BnWRKY28過表達轉(zhuǎn)基因油菜。與對照Westar相比，過表達植株在生長發(fā)育上表現(xiàn)出種子發(fā)芽異常、幼苗下胚軸變短、側(cè)根發(fā)育減少而主根增長、植株變矮小、葉型改變以及種子成熟異常等相關(guān)表型。
　　5 BnWRKY28參與GA路徑調(diào)控的分析
　　通過施加外源GA能夠部分恢復(fù)過表達株的下胚軸變短的表型，對GA合成代謝及信號傳導(dǎo)途徑的的相關(guān)基因表達分析顯示，在BnWRKY

7、28過表達株中，GA合成路徑關(guān)鍵合成酶基因GA20ox1顯著下調(diào)表達，而起鈍化作用的基因GA2ox1/GA2ox2上調(diào)表達，受GA負向調(diào)控的GA靶基因GID1a、GID1b、SLY1呈上調(diào)表達的趨勢，BnWRKY28參與了GA路徑的調(diào)控。
　　6 BnWRKY28參與生物與非生物脅迫的分析
　　對幼苗內(nèi)源激素JA和SA含量測定顯示，過表達株內(nèi)源JA含量顯著下降而SA含量無顯著變化，基因表達分析顯示過表達株中與SA途徑相關(guān)的基

8、因呈上調(diào)表達的趨勢，而與JA途徑相關(guān)的基因呈下調(diào)表達趨勢，過表達Bn WRKY28后植株對真菌性病害灰霉病菌的抗性似乎減弱了，說明BnWRKY28很可能參與正調(diào)控SA抗病信號途徑而負調(diào)控JA抗病信號途徑;此外，對幼苗用PEG-6000模擬干旱處理時，過表達株表現(xiàn)出對PEG-6000耐受性增強，說明BnWRKY28很可能也參與了植物滲透脅迫的調(diào)節(jié)。
　　綜上所述，BnWRKY28在植物的生長發(fā)育中起到了重要調(diào)控作用，同時也參與了植物