固體健腦法對老年健忘模型大鼠作用的理論及實驗研究.pdf

1、目的：建立老年健忘大鼠模型。分別按照補脾、補腎和固本(補脾腎)三種治療原則，選擇藥物作用于模型動物，觀察給藥后動物記憶功能的改變，從功能、細胞、分子水平詮釋固本健腦法改善記憶的作用機理。依據(jù)實驗結(jié)果，闡釋“固本一健腦”理論的科學(xué)內(nèi)涵，明確老年健忘與中醫(yī)脾腎的關(guān)系，探討老年健忘的中醫(yī)病因病機，為尋求中醫(yī)改善記憶的方藥提供依據(jù)，為中醫(yī)藥防治腦機能退化做初步探索，豐富和補充中醫(yī)脾腎理論的內(nèi)容。 方法：采用文獻研究的方法，對古代醫(yī)家關(guān)于

2、健忘的理論探討進行系統(tǒng)回顧，從文獻中找出先賢對健忘的認識，深入探討記憶的生理基礎(chǔ)和健忘的病理機制，按照中醫(yī)理論，進一步總結(jié)出健忘的病因病機。 結(jié)合導(dǎo)師組治療老年健忘的經(jīng)驗，依據(jù)從古今文獻中總結(jié)出的健忘的病因病機理論，篩選藥物組成補脾健腦方(黨參、茯苓、山楂、石菖蒲等)、補腎健腦方(杞果、何首烏、山楂、石菖蒲等)和固本健腦方(黨參、杞果、何首烏、茯苓、山楂、石菖蒲等)，以動物實驗的方式驗證該病因病機理論的科學(xué)性。 課題組前

3、期的研究結(jié)果已證實固本健腦方可以改善記憶，但對其產(chǎn)生療效的分子機制和補脾與補腎的療效差異，沒有做深入研究。為明確脾腎影響記憶的具體環(huán)節(jié)，又將該方拆方為補脾健腦方和補腎健腦方，與固本健腦方一起分別作用于模型動物，觀察其產(chǎn)生療效的機制。從功能、細胞、分子等不同層次揭示3種療法產(chǎn)生療效的具體機制。 用跳臺法篩選記憶能力相當(dāng)?shù)膭游?，隨機分為正常組和模型組。正常組15只，模型組60只。正常組每天腹腔注射生理鹽水2ml，模型組腹腔注射D-半

4、乳糖和NaNO2，連續(xù)40天，以復(fù)制老年健忘動物模型。造模結(jié)束后，以跳臺法和morrise水迷宮法檢測造模結(jié)果。將造模成功后的模型組動物，按照完全隨機法再分為補脾組、補腎組、固本組和模型組，每組15只。與正常組一起，使實驗動物總數(shù)達到5組，75只。 正常組和模型組動物每天灌胃生理鹽水2ml，其余3個治療組分別以補脾健腦方、補腎健腦方和固本健腦方水煎液灌胃。按照人與動物體表面積折算法，算得大鼠等效劑量分別為每公斤體重50g(固本健

5、腦方)生藥、40g生藥(補脾健腦方、補腎健腦方)。濃縮各方藥液使每毫升藥液含生藥2g，每次灌胃2ml，連續(xù)20天。 灌胃結(jié)束后，進行行為學(xué)檢測。檢測結(jié)束后，各組動物禁食12h，1-10 號動物斷頭取血，3000r·min-1離心10min，取血清按試劑盒說明書中方法，測定SOD的活力和MDA的含量。取大腦皮層檢測Na+-K+-ATP酶活性；取左側(cè)海馬檢測C-FOS基因表達；取右側(cè)海馬檢測谷氨酸受體NR2A基因表達。 11

6、～15號大鼠，行為學(xué)檢測結(jié)束后，取鼠腦固定后，常規(guī)方法進行免疫組化染色，檢測神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(NT-3)和HSP70表達。 結(jié)果：造模結(jié)束后，模型組動物皮毛干枯、稀疏、脫落，目眵增多，活動量減少，生長發(fā)育遲緩，精神萎靡，飲水量、進食量明顯少于正常組，表現(xiàn)出明顯的衰老狀態(tài)，符合衰老動物的特征。給藥結(jié)束后，跳臺法檢測，正常組潛伏期明顯高于模型組(P<0.01)，補腎組、固本組成績高于模型組(P<0.01)。5

7、分鐘內(nèi)錯誤次數(shù)檢測，補脾組、補腎組和固本組均低于模型組(P<0.01或P<0.05)。固本組動物成績優(yōu)于補脾組(P<0.05)和補腎組(P<0.01)。Morrise水迷宮法檢測，模型組動物找到隱匿平臺的時間明顯長于正常組(P<0.01)。3個治療組的動物找到平臺的時間均低于模型組，其中固本組療效最好，基本接近正常組(P>0.05)。 平臺撤除后，正常組和各給藥組動物穿越平臺的次數(shù)均明顯高于模型組(P<0.01或P<0.05)。

8、固本組療效明顯優(yōu)于補脾組(P<0.01)和補腎組(P<0.05)，與正常組比較P>0.05。與正常組比較，模型組動物在平臺所在象限(C區(qū))的游泳時間明顯減少(P<0.01)。各給藥組動物C區(qū)游泳時間均高于模型組(P<0.01或P<0.05)，固本組療效優(yōu)于補脾組和補腎組(P<0.01)。 模型組動物血清SOD活性明顯低于正常組(P<0.01)，固本組明顯高于模型組(P<0.05)。模型組動物血清MDA含量明顯高于正常組(P<0.

9、01)，各給藥組MDA含量有不同程度降低，但3組之間的差異無意義。 模型組動物大腦皮層Na+-K+ATP酶活性比正常組極顯著降低(P<0.01)；補脾組和固本組活性均高于模型組(P<0.01或P<0.05)． 正常組、補脾組、固本組NGF陽性表達均明顯高于模型組(P<0.01或P<0.05)，補腎組NGF表達明顯低于固本組(P<0.05)。正常組NT-3免疫陽性表達的細胞數(shù)和陽性細胞灰度值均明顯高于模型組(P<0.05)

10、，與NGF檢測結(jié)果一致。 正常組大鼠腦內(nèi)未見HSP70免疫反應(yīng)陽性細胞。各治療組動物海馬腦區(qū)HSP70免疫陽性細胞數(shù)均高于模型組(P<0.01)，以固本組療效最佳，其HSF70免疫陽性細胞數(shù)明顯高于補脾和補腎組(P<0.01)。正常組c-fosmRNA表達低于模型組(P<0.01)，3個治療組均高于模型組(P<0.01)，固本組明顯高于補腎組(P<0.05)，但和補脾組比較差異無意義(P>0.05)。 正常組動物海馬有一

11、定量的NR2AmRNA表達，明顯高于模型組(P<0.05)，補腎組和固本組NR2AmRNA表達較模型組明顯增高(P<0.01)，其中固本組療效最好，明顯高于正常組(P<0.01)。 結(jié)論：綜合以上研究結(jié)果課題組認為，老年健忘是一個病變涉及多個臟腑，又與氣血痰濁密切相關(guān)的綜合性復(fù)雜病癥，但其中心環(huán)節(jié)是脾腎二臟。糾正了脾腎的虧損，就解決了病變的關(guān)鍵。聯(lián)合使用D-半乳糖與亞硝酸鈉腹腔注射，可以較好復(fù)制老年健忘動物模型。固本健腦法可以通