利用噬菌體12肽庫(kù)篩選豬傳染性胸膜肺炎的抗原模擬表位.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎（PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（ APP）引起的豬的一種高度傳染性呼吸道疾病。本研究利用噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)對(duì)APP菌體及3種主要外毒素（APxⅠ、APxⅡ與APxⅢ）的抗原模擬表位進(jìn)行了篩選，并對(duì)展示在噬菌體表面的模擬表位的免疫原性進(jìn)行了初步鑒定。主要結(jié)果如下： 1．豬傳染性胸膜肺炎菌體抗原模擬表位的篩選 利用豬傳染性胸膜肺炎疫苗免疫日本大耳兔得到抗血清，將血清用飽和硫酸銨粗提后，再經(jīng)低壓層析系統(tǒng)純化得到

2、IgG，用此IgG為配體包被酶標(biāo)板對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行3輪不同條件的富集篩選。經(jīng)過(guò)3輪篩選，噬菌體的回收率從5.76×10<'-5>增加到了1.69×10<'-2>，P／N值逐步提高，陽(yáng)性克隆得到了富集；ELISA表明，隨機(jī)挑取的10個(gè)噬菌體中有6個(gè)與純化的IgG有較強(qiáng)的結(jié)合能力，且與無(wú)關(guān)抗體無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。梯度ELISA表明，陽(yáng)性噬菌體克隆與抗血清的結(jié)合呈劑量依賴關(guān)系。在每一輪的篩選過(guò)程中，將洗脫下來(lái)的噬菌體再用正常的兔血

3、清IgG進(jìn)行吸附，去除了假陽(yáng)性的噬菌體克隆，保證了陽(yáng)性噬菌體克隆的特異性。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，所得到的6個(gè)噬菌體陽(yáng)性克隆中，有5個(gè)陽(yáng)性克隆遞呈相同的氨基酸序列。 2．豬傳染性胸膜肺炎3種主要外毒素抗原模擬表位的篩選與鑒定 將豬傳染性胸膜肺炎3種主要外毒素（APxⅠ、APxⅡ與APxⅢ）的抗血清用飽和硫酸銨粗提后，再經(jīng)低壓層析系統(tǒng)得到純化的IgG，用此IgG作配體包被酶標(biāo)板對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)分別進(jìn)行不同條件的富集篩選。經(jīng)

4、過(guò)4輪篩選，噬菌體的回收率與P/N值逐步提高；ELISA表明，隨機(jī)分別挑取的10個(gè)噬菌體中，有5個(gè)與純化的IgG有較強(qiáng)的結(jié)合能力，且無(wú)交叉反應(yīng)。在篩選過(guò)程中，我們采取外毒素蛋白抗原競(jìng)爭(zhēng)洗脫的方法，而不是酸洗脫的方法，保證了陽(yáng)性噬菌體克隆的特異性。DNA測(cè)序結(jié)果顯示，所得到的噬菌體模擬表位與3種主要外毒素蛋白之間有較高的同源性。 3．噬菌體抗原模擬表位的免疫原性研究 利用篩選到的噬菌體陽(yáng)性克隆、豬傳染性胸膜肺炎全菌滅活苗與