噬菌體展示技術(shù)篩選表皮生長因子受體抗原模擬表位.pdf

1、結(jié)直腸癌已成為我國繼肺癌、胃癌、肝癌后的第四大最常見癌癥。既往研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在結(jié)直腸癌中常出現(xiàn)過表達(dá)，并進(jìn)一步通過其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡抑制，因此，EGFR已成為抗腫瘤藥物的一個(gè)理想靶點(diǎn)。經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市，針對EGFR抗原表位研制的單克隆抗體藥物有尼妥珠單抗和西妥昔單抗。這兩株單抗在治療 EGFR高表

2、達(dá)的結(jié)直腸癌及其他腫瘤中，能專一的針對腫瘤細(xì)胞，減少對正常組織的損害，顯著提高患者的生存狀態(tài)。但其存在一定的不足，首先，分子量相對較大，降低了單抗藥物的治療效果，導(dǎo)致臨床使用效果不理想。其次，價(jià)格昂貴，且在治療過程中需長期使用，給病人及家屬帶來了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如果能將單抗藥物與其靶點(diǎn)結(jié)合的位點(diǎn)模擬出來，制成多肽疫苗，就可以避免單克隆抗體藥物的不足，大大提高治療效果，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。模擬抗原表位的方法有兩種，通過將噬菌體展示技術(shù)與傳

3、統(tǒng)的抗原表位分析方法相比，我認(rèn)為噬菌體展示技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。
　　噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白基因序列插入至噬菌體外殼蛋白，隨著噬菌體的重新組裝將外源蛋白融合在噬菌體的表面，其在抗原表位篩選中的優(yōu)點(diǎn)是既可識(shí)別并結(jié)合腫瘤抗原，又能感染宿主菌進(jìn)行擴(kuò)增。噬菌體隨機(jī)肽庫包含大量不同序列結(jié)構(gòu)的多肽，其可以作為任何靶抗原表位的模擬肽，通過肽庫對靶抗原進(jìn)行篩選時(shí)，不需要空間構(gòu)象，只需靶抗原就可獲得具有抗原性和免疫原性的蛋白多肽，且反映了抗原結(jié)合

4、位點(diǎn)的空間構(gòu)像。目前該技術(shù)在腫瘤的基礎(chǔ)研究以及治療新技術(shù)的開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用。
　　本實(shí)驗(yàn)擬用尼妥珠單抗及西妥昔單抗分別作為抗EGFR的靶標(biāo)蛋白，應(yīng)用噬菌體隨機(jī)十二肽庫對其抗原表位進(jìn)行探討分析。用兩株單克隆抗體藥物對同一靶點(diǎn)抗原表位進(jìn)行篩選分析，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。擬經(jīng)過三輪噬菌體的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的親和篩選實(shí)驗(yàn)，獲得與單抗特異性結(jié)合的單克隆噬菌體，進(jìn)而對噬菌體提取單鏈DNA并測序，獲得抗 EGFR抗體對應(yīng)抗原表位的氨基酸序列

5、，對兩株單抗獲得的氨基酸序列進(jìn)行分析比較。采用競爭 ELISA檢測方法，將篩選出高頻的單克隆噬菌體與EGFR高表達(dá)的caco2細(xì)胞膜蛋白提取液競爭結(jié)合西妥昔單抗及尼妥珠單抗，進(jìn)一步檢測所獲得的短肽與西妥昔單抗及尼妥珠單抗的親和活性，并對兩株單抗獲得短肽的親和性進(jìn)行分析比較，以尋找最具親和活性的短肽。
　　目的:
　　1.利用噬菌體十二肽庫進(jìn)行生物淘洗，篩選表皮生長因子受體抗原模擬表位。
　　2.篩選出的模擬短肽的生物活

6、性檢測。
　　方法:
　　以尼妥珠單抗及西妥昔單抗作為抗EGFR抗原的靶分子，在噬菌體十二肽庫中淘選表皮生長因子受體的抗原模擬表位，經(jīng)過3輪生物淘洗后，挑選單克隆噬菌斑進(jìn)行擴(kuò)增，用ELISA方法檢測，選擇與西妥昔單抗或尼妥珠單抗親和性較高的陽性單克隆噬菌體，對其進(jìn)行擴(kuò)增及測序。
　　采用競爭ELISA的方法，對篩選出的高頻噬菌體單克隆與EGFR高表達(dá)的caco2細(xì)胞膜蛋白提取液競爭結(jié)合西妥昔單抗及尼妥珠單抗。
　

7、　結(jié)果:
　　1.以抗EGFR的單克隆抗體藥物西妥昔單抗作為靶標(biāo)蛋白，利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫對靶蛋白進(jìn)行三輪生物淘洗，對每輪淘洗出來的噬菌體均進(jìn)行噬菌體滴度測定，測定結(jié)果可以看出，西妥昔單抗淘篩出來的噬菌體總體回收率從第一輪的（6.67×10-6）％增加到了第三輪的（2.80×10-3）%，可見通過三輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的生物淘洗，噬菌體回收率得到了富集，富集率達(dá)到了420倍。用同樣的方法對尼妥珠單抗進(jìn)行淘洗，對淘洗結(jié)果進(jìn)行滴度

8、測定，測定結(jié)果可以看出，尼妥珠單抗淘選出來的噬菌體總體回收率從第一輪的（8.67×10-6）%增加到了第三輪的（1.80×10-3）%，可見尼妥珠單抗通過三輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的生物淘洗，噬菌體的回收率也得到富集，富集度為208倍。
　　2.在第三輪測噬菌體滴度的平板中，分別隨機(jī)挑選30個(gè)分隔良好的單克隆藍(lán)斑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后行滴度測定，以擴(kuò)增的單克隆噬菌體作為檢測組，以噬菌體原庫擴(kuò)增液作陰性對照組，進(jìn)行ELISA檢測。在陽性結(jié)果

9、的評價(jià)中，以單克隆噬菌體擴(kuò)增液（檢測組）的OD值為噬菌體原庫擴(kuò)增液（陰性對照）的OD值的2倍以上視為陽性。以此標(biāo)準(zhǔn)對ELISA結(jié)果進(jìn)行分析，確定西妥昔單抗的陽性結(jié)果有17個(gè)，而尼妥珠單抗的陽性結(jié)果有21個(gè)，陽性率分別為56.67%和70%。這表明西妥昔單抗及尼妥珠單抗均淘篩出來了特異性結(jié)合的噬菌體。隨機(jī)挑選陽性噬菌體克隆進(jìn)行依賴性分析，可見隨著陽性噬菌體投入量的增加，其OD值也增大，說明其存在劑量依賴性。
　　3.對檢測出來的陽性

10、噬菌體克隆提取單鏈DNA，并進(jìn)行DNA序列測定，找出插入噬菌體的36個(gè)堿基，并將其翻譯成氨基酸，此即為噬菌體遞呈的12肽序列。對17個(gè)陽性的西妥昔單抗噬菌體進(jìn)行測序，有三段短肽頻率出現(xiàn)較高，分別為HSFKWLDSPRLR出現(xiàn)6次，HTSSLWHLFRST出現(xiàn)4次，HLFNHNKNLPKR出現(xiàn)3次。對21個(gè)陽性的尼妥珠單抗噬菌體進(jìn)行測序，出現(xiàn)兩段頻率較高的短肽，分別為HSFKWLDSPRLR出現(xiàn)8次，HWKSSYVKWHNV出現(xiàn)5次。其中

11、西妥昔單抗和尼妥珠單抗有一共有序列HSFKWLDSPRLR。
　　4.在競爭ELISA實(shí)驗(yàn)中，EGFR高表達(dá)的caco2細(xì)胞膜蛋白提取液可以與噬菌體單克隆HSFKWLDSPRLR，HTSSLWHLFRST，HLFNHNKNLPKR競爭性結(jié)合西妥昔單抗，三條短肽均出現(xiàn)不同程度的抑制。 EGFR高表達(dá)的caco2細(xì)胞膜蛋白提取液與噬菌體單克隆HSFKWLDSPRLR，HWKSSYVKWHNV競爭性結(jié)合尼妥珠單抗，兩條短肽均出現(xiàn)不同程度