SDF-1α基因的克隆及其對(duì)THP-1細(xì)胞的遷移作用.pdf

1、背景：動(dòng)脈粥樣硬化是一種動(dòng)脈血管壁慢性炎癥性疾病，其確切機(jī)制還未完全闡明，很多因素可促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。而趨化因子是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1α（stromal cell derived- factor 1 alpha）是一類具有趨化活性的細(xì)胞因子，研究證實(shí)它在造血干細(xì)胞遷移及歸巢、惡性腫瘤尤其血液腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以其HIV感染方面發(fā)揮著重要作用。近幾年來SDF-1α在動(dòng)脈硬化性疾病中的作用也開始引起重視。 本研究

2、應(yīng)用RT-PCR法從大鼠血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cells,Vsmcs;）中克隆出SDF-1α基因，并對(duì)其序列進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析；然后構(gòu)建EGFP-C1- SDF-1α重組質(zhì)粒進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；最后構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SDF-1α,研究其對(duì)單核細(xì)胞的趨化作用。 目的：克隆大鼠SDF-1α基因，并對(duì)大鼠SDF-1α基因序列進(jìn)行分析；分析SDF-1α蛋白亞細(xì)胞定位；探討重組SDF

3、-1α蛋白對(duì)單核細(xì)胞的趨化作用。 方法：從大鼠Vsmcs中提取mRNA,用RT-PCR從中擴(kuò)增出SDF-1α基因,將擴(kuò)增片段克隆于pMD-T18載體中,轉(zhuǎn)化DH5α菌；進(jìn)行藍(lán)白篩選后,運(yùn)用PCR和酶切鑒定并DNA測(cè)序；利用生物信息學(xué)方法對(duì)SDF-1α基因的序列進(jìn)行分析。構(gòu)建EGFP-C1- SDF-1α表達(dá)載體，酶切鑒定，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ecv304內(nèi)皮細(xì)胞株,48h后用熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)；構(gòu)建重組質(zhì)粒

4、pcDNA3.1-SDF-1α，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Ecv304內(nèi)皮細(xì)胞株，經(jīng)G418篩選陽(yáng)性克隆，RT-PCR驗(yàn)證，建立SDF-1α轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，再用小室遷移實(shí)驗(yàn)來研究SDF-1α對(duì)THP-1單核細(xì)胞的趨化作用。 結(jié)果：PCR擴(kuò)增得到378bp的基因片段,經(jīng)酶切初步證實(shí)為SDF-1α基因;陽(yáng)性克隆經(jīng)篩選鑒定連接有目的基因;目的基因測(cè)序結(jié)果與GeneBank上序列比較,結(jié)果完全一致,表明靶基因成功插入pMD–T；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

5、法將重組質(zhì)粒EGFP-C1- SDF-1α瞬時(shí)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SDF-1α轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)G418篩選陽(yáng)性克隆，RT-PCR驗(yàn)證，表明建立了SDF-1α轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，小室遷移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SDF-1α對(duì)THP-1單核細(xì)胞的具有明顯趨化作用。 結(jié)論：成功克隆了SDF-1α基因，SDF-1α蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，重組的SDF-1α對(duì)單核細(xì)胞具有趨化