LPS對(duì)THP-1細(xì)胞CD14表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 從蛋白質(zhì)和基因兩個(gè)水平觀察脂多糖(LPS)對(duì)THP-1(Humanacutemonocyticleukemiacellline)細(xì)胞可溶性CD14(SolubleCD14，sCD14)、膜CD14(MembraneCD14，mCD14)及CD14mRNA表達(dá)的影響及sCD14、mCD14與CD14mRNA表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 培養(yǎng)的THP-1單核細(xì)胞株，加入佛波脂(PHORBOL12

2、-MYRISTATE13-ACETATE，PMA)誘導(dǎo)分化成THP-1巨噬細(xì)胞。在THP-1巨噬細(xì)胞中加入不同濃度的LPS，刺激不同的時(shí)間。用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中sCD14蛋白質(zhì)的含量；用流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞膜mCD14蛋白質(zhì)的量；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CD14mRNA的表達(dá)情況。采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟

3、件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)多因素方差分析法比較不同質(zhì)量濃度LPS不同時(shí)間刺激細(xì)胞sCD14、mCD14及CD14mRNA表達(dá)的變化，直線相關(guān)分析sCD14、mCD14及CD14mRNA表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1、PMA誘導(dǎo)THP-1單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化后，細(xì)胞由懸浮生長(zhǎng)變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)中PMA誘導(dǎo)6h時(shí)觀察已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁，18h大部分細(xì)胞已經(jīng)完成貼壁，24h后所有細(xì)胞幾乎完全貼壁。
　　 2、不同

4、質(zhì)量濃度LPS不同時(shí)間刺激細(xì)胞sCD14表達(dá)量的變化
　　 在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系上：隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，sCD14的表達(dá)增強(qiáng)，3、5h和0.5、1、8h相比，sCD14的表達(dá)均有顯著性差異(P＜0.01);LPS濃度為0ng/ml時(shí)，sCD14的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)r=0.915，P=0.029＜0.05，8h達(dá)最高值(1044.39士12.21)，與0.5h(265±13.93)和1h(201.45±9.46)比

5、較有顯著性差異(P＜0.01);LPS濃度為0.1ng/ml時(shí)，8hsCD14的表達(dá)（445.64±8.64）降幅最大，與對(duì)照（1044.39士12.21）比較有顯著性差異(P＜0.01);LPS濃度為10ng/ml時(shí)，5hsCD14的表達(dá)達(dá)最高值(1216.66±3.35)，與其余各組比較有顯著性差異(P＜0.05);LPS濃度為100ng/ml時(shí)，3hsCD14的表達(dá)達(dá)最高值(1320.25±107.37)，與對(duì)照(768.43±1

6、9.98)及其余各組比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 在劑量-效應(yīng)關(guān)系上：隨著LPS濃度的增高，3、5、8hsCD14的表達(dá)變化較大；當(dāng)LPS刺激細(xì)胞3h時(shí)，sCD14的表達(dá)隨LPS濃度的升高而增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)r=0.963，P=0.002＜0.01，且100ng/ml時(shí)達(dá)最高值(1320.25±107.37)，與對(duì)照(768.43±19.98)比較有顯著性差異(P＜0.01);5h時(shí)，sCD14的表達(dá)隨LPS濃度的增高先

7、增強(qiáng)后減弱，10ng/ml時(shí)達(dá)最高值(1216.66±3.35);刺激8h，sCD14的表達(dá)隨LPS濃度的增高而減弱，0.1ng/ml時(shí)sCD14的表達(dá)降幅最大(445.64±8.64)，100ng/ml時(shí)達(dá)最低值（211.6±14.14），與對(duì)照(1044.39±12.21)比較有顯著性差異(P＜0.01)。3、不同質(zhì)量濃度LPS不同時(shí)間刺激細(xì)胞mCD14表達(dá)量的變化
　　 在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系上：隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，mCD

8、14的表達(dá)增強(qiáng)，3、5hmCD14的表達(dá)最高；LPS濃度為0ng/ml時(shí)，mCD14的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)r=0.945，P=0.015＜0.05，8h達(dá)最高值（4.23％士2.11％），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，sCD14的表達(dá)與mCD14的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.969，P=0.006＜0.01;LPS濃度為0.1ng/ml時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)mCD14的表達(dá)先增高后降低，8h（1.95％士0.74％）降幅最大，與對(duì)照（4.

9、23％士2.11％）比較有顯著性差異(P＜0.01)，但時(shí)間與mCD14的表達(dá)之間無(wú)相關(guān)性，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，sCD14的表達(dá)與mCD14的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.944，P=0.016＜0.05；刺激前3h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)mCD14的表達(dá)增強(qiáng)，當(dāng)LPS濃度為100ng/ml時(shí)達(dá)最高值（6.9％士2.19％）；直至5h，LPS濃度為1ng/ml時(shí)mCD14的表達(dá)開(kāi)始減弱。
　　 在劑量-效應(yīng)關(guān)系上：隨著LPS濃度的增高，

10、3、5、8hsCD14的表達(dá)變化較大；當(dāng)LPS刺激細(xì)胞0.5h時(shí)，濃度與mCD14的表達(dá)之間無(wú)相關(guān)性，而隨著LPS濃度的增高sCD14的表達(dá)與mCD14的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.839，P=0.037＜0.05;1h時(shí)，mCD14的表達(dá)隨LPS濃度的升高而增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)r=0.839，P=0.037＜0.05，100ng/ml時(shí)達(dá)最高值(3.24±1.95)，與對(duì)照(1.25％士0.34％)比較有顯著性差異(P＜0.01);3h

11、時(shí)，100ng/ml時(shí)達(dá)最高值（6.9％±2.19％），與對(duì)照（2.41％士1.09％）比較有顯著性差異(P＜0.01);5h時(shí)，mCD14的表達(dá)隨LPS濃度的增高先增強(qiáng)后減弱，1ng/ml時(shí)達(dá)最高值（6.42％士2.18％）；刺激8h，mCD14的表達(dá)都比對(duì)照弱，1、10ng/ml時(shí)達(dá)最低值(1.58％±0.48％)與對(duì)照（4.23％±2.11％）比較有顯著性差異（P＜0.01）。
　　 4、不同質(zhì)量濃度LPS不同時(shí)間刺激細(xì)胞

12、CD14mRNA表達(dá)量的變化
　　 在時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系上：隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，CD14mRNA的表達(dá)增強(qiáng)，3hCD14mRNA的表達(dá)最高；起始3h，CD14mRNA的表達(dá)隨LPS濃度增高而增強(qiáng)，LPS濃度為100ng/ml時(shí)達(dá)最高值為對(duì)照的256倍(P＜0.01);5hCD14mRNA的表達(dá)明顯減弱，LPS濃度為0.1ng/ml時(shí)達(dá)最低值僅為對(duì)照的1/64(P＜0.01)，接著隨LPS濃度增高而增強(qiáng)，但是都低于對(duì)照(P＜0.

13、05);8h時(shí)CD14mRNA的表達(dá)呈雙向表達(dá)，在LPS濃度為10ng/ml時(shí)達(dá)最高值為對(duì)照的64倍(P＜0.01)。CD14mRNA的表達(dá)與LPS的刺激時(shí)間之間無(wú)相關(guān)性。
　　 在劑量-效應(yīng)關(guān)系上：隨著LPS濃度的增高，CD14mRNA的表達(dá)變化較大；當(dāng)LPS刺激細(xì)胞0.5h時(shí)，CD14mRNA的表達(dá)隨著濃度的增高而增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)r=0.813，P=0.049＜0.05，100ng/ml時(shí)達(dá)最高值為對(duì)照的256倍（P＜0.01

14、），而sCD14與CD14mRNA的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.884，P=0.019＜0.05;3h時(shí)，CD14mRNA的表達(dá)與濃度間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.822，P=0.041＜0.05，且隨著LPS濃度的增高CD14mRNA與mCD14的表達(dá)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.988，P＜0.01，而sCD14與CD14mRNA的表達(dá)之間無(wú)相關(guān)性，r=0.736，P=0.095＞0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1

15、、PMA可以誘導(dǎo)懸浮生長(zhǎng)的THP-1細(xì)胞為具有巨噬細(xì)胞性質(zhì)的貼壁細(xì)胞。
　　 2、未經(jīng)LPS刺激的THP-1細(xì)胞可以自發(fā)表達(dá)sCD14、mCD14及CD14mRNA。
　　 3、LPS的濃度及刺激細(xì)胞的時(shí)間影響sCD14、mCD14及CD14mRNA表達(dá)。
　　 4、3hsCD14的表達(dá)與LPS濃度間具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 5、LPS濃度為0ng/ml時(shí)，mCD14的表達(dá)與時(shí)間正相關(guān)，mCD14與sC

16、D14的表達(dá)呈正相關(guān)；LPS濃度為0.1ng/ml時(shí)，mCD14與sCD14的表達(dá)呈正相關(guān)。LPS刺激細(xì)胞0.5h時(shí)，mCD14的表達(dá)與LPS濃度無(wú)相關(guān)性，mCD14與sCD14的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；1h時(shí)，mCD14的表達(dá)與LPS濃度呈正相關(guān)。
　　 6、LPS刺激細(xì)胞0.5h時(shí)，CD14mRNA的表達(dá)與濃度呈正相關(guān)，CD14mRNA與sCD14的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；3h時(shí)，CD14mRNA的表達(dá)與濃度呈正相關(guān)，CD14mRNA與mCD1