臍帶間充質(zhì)干細胞聯(lián)合臍血干細胞治療Ⅰ型糖尿病的初步研究.pdf

1、目的：建立一種簡便、高效臍帶間充質(zhì)干細胞分離方法。 方法：臍帶組織剔除血管后，余下的組織用不同酶混合液消化，消化后的細胞懸液培養(yǎng)在含10ng/mlbFGF和10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，粘附層細胞用胰酶消化傳代培養(yǎng)。通過流式細胞術(shù)及免疫細胞化學(xué)方法檢測細胞的免疫表型，在標(biāo)準的成骨成脂誘導(dǎo)分化條件下檢測細胞的分化潛能。 結(jié)果：臍帶組織應(yīng)用中性蛋白酶、膠原酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶混合液消化后，每5cm長度的臍帶可分離1×1

2、06單個核細胞，培養(yǎng)10天后可得2.2×106細胞。傳代培養(yǎng)后，細胞為均一的成纖維樣長梭形。應(yīng)用此種方法在分離難度、細胞得率等方面明顯優(yōu)于其它酶或酶混合液消化方法。分離培養(yǎng)后的細胞，倍增時間為（34±4）h，表達與骨髓間質(zhì)細胞一致的表面標(biāo)志（CD29、CD90、vimentin、SMA、desmin），不表達造血和內(nèi)皮細胞標(biāo)志（CD34、CD45、CD31、KDR），并表達多能干細胞標(biāo)志（SSEA4、OCT-4），同時具有向成骨、成脂細

3、胞分化的能力。 結(jié)論：應(yīng)用三種酶的混合液消化間質(zhì)組織分離臍帶間充質(zhì)干細胞，操作簡便，分離過程中，保持了細胞活力，細胞產(chǎn)量高，可以為臨床應(yīng)用提供大量高質(zhì)量種子細胞。 目的：探討臍帶間充質(zhì)干細胞能否在體外向胰島素分泌細胞分化。 方法：用含β-巰基乙醇、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、B27及尼克酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細胞向胰島素分泌細胞分化。相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化；誘導(dǎo)階段采用流式術(shù)檢測

4、PDX-1的表達；誘導(dǎo)后采用免疫化學(xué)染色檢測胰島素和C肽的表達：化學(xué)發(fā)光法測定低糖/高糖刺激下胰島素的分泌情況；RT-PCR檢測胰腺相關(guān)基因的表達，如Ngn3、insulin、glucagon和somatostatin的表達。 結(jié)果：誘導(dǎo)后細胞形態(tài)由長梭形逐漸變圓而且聚集成團，誘導(dǎo)第二階段表達PDX-1，誘導(dǎo)第三階段后細胞免疫化學(xué)染色表達胰島素和C肽，誘導(dǎo)組細胞經(jīng)高糖刺激后釋放胰島素，RT-PCR可檢測到insulin、Gluc

5、agon、Somatostatin、ngn3等胰島相關(guān)基因。 結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細胞在特定的條件下可誘導(dǎo)分化為具有分泌胰島素功能的胰島樣細胞。 目的：觀察hUCMSCs聯(lián)合臍血干細胞在Ⅰ型糖尿病治療中的作用。 方法：連續(xù)小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）給C57/BL6雄鼠，觀察血糖濃度與糖耐量水平，建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型。建模后，將hUCMSCs與臍血干細胞按不同比例，細胞總數(shù)量2×106細胞，通過尾靜脈移植

6、給受亞致死劑量（300cGy）照射后小鼠，觀察血糖變化。移植后28天，胰腺組織切片行人源胰島素免疫化學(xué)染色檢測植入細胞是否分化為胰島素分泌細胞，HE染色和小鼠胰島素免疫化學(xué)染色檢測受損的胰島是否得到修復(fù)。為了解植入細胞在組織中的定位，免疫化學(xué)染色法檢測腎臟及胰腺組織切片中的人核抗原，抽提腎臟及胰腺DNA經(jīng)PCR方法檢測人特異性Alu基因。 結(jié)果：注射STZ后7天，兩次隨機血糖大于16mmol/L的小鼠為Ⅰ型糖尿病小鼠。將hUCM

7、SCs與臍血干細胞按1：4比例移植入糖尿病小鼠體內(nèi)，能明顯地改善胰島的結(jié)構(gòu)和功能，小鼠血糖水平明顯降低，胰島素分泌細胞的數(shù)量增加。然而在移植小鼠的胰腺沒有檢測到人胰島素分泌細胞和人核抗原。進一步，通過檢測人特異性Alu基因，分析了移植小鼠胰腺和腎臟組織中是否存在移植細胞。結(jié)果顯示，在部分移植小鼠體內(nèi)存在人特異性Alu基因DNA，提示移植細胞在糖尿病小鼠胰腺和腎臟組織中存在。 結(jié)論：hUCMSCs聯(lián)合臍血干細胞移植后可定位于Ⅰ型糖