Neurocan基因蛋白表達(dá)及其抗體制備與檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）損傷后的修復(fù)受多種因素影響，其中抑制因子釋放和膠質(zhì)瘢痕形成為主要原因之一。目前已經(jīng)分離和鑒定的軸突生長(zhǎng)抑制因子有：Nogo-A、髓磷脂相關(guān)糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp）等。研究發(fā)現(xiàn)，Nogo-A、MAG、OMgp發(fā)

2、生作用時(shí)都有LINGO-1蛋白的參與。在膠質(zhì)瘢痕對(duì)軸突再生的影響中，硫酸軟骨素蛋白多糖（Chondroitin Sulphate Proteoglycans，GSPGs）是目前已知的一個(gè)阻礙軸突再生的重要因子，特異存在于CNS，而Neurocan則為GSPGs的核心蛋白組分之一，并且顯示了對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)突生長(zhǎng)的抑制作用。腱糖蛋白-R（tenascin-R，TN-R）是瘢痕組織中所含有的另一種有軸突生長(zhǎng)抑制作用的細(xì)胞外基質(zhì)成分。把

3、LINGO-1、Neurocan和TN-R設(shè)計(jì)成三基因聯(lián)合DNA疫苗，將會(huì)使疫苗在體內(nèi)發(fā)揮作用后、產(chǎn)生抗體并與相關(guān)抑制因子結(jié)合，以消除抑制作用、促進(jìn)神經(jīng)再生。本研究則主要是進(jìn)行Neurocan基因的蛋白表達(dá)及其抗體制備，并且對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，探討DNA疫苗制作前期技術(shù)方案的可行性，為后續(xù)CNS損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)工作奠定基礎(chǔ)。 目的： 制備N(xiāo)eurocan蛋白，用此蛋白免疫動(dòng)物制備抗血清，并對(duì)抗血清的效價(jià)和特異性進(jìn)行檢測(cè)，最終使待參

4、與DNA疫苗構(gòu)成的Neurocan蛋白所產(chǎn)生抗體能與腦內(nèi)創(chuàng)傷區(qū)的相應(yīng)抑制性蛋白抗原結(jié)合。 方法： 從基因庫(kù)調(diào)出Neurocan的基因序列，合成Neurocan基因，序列起始端加His標(biāo)簽，兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)。構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒PET30a（+）-Neurocan，對(duì)合成的Neurocan基因進(jìn)行測(cè)序鑒定。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)，挑菌培養(yǎng)，使用OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒（E.Z.N.A. TM Plasmid M

5、ini KitⅡ50）提取質(zhì)粒。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定正確后，對(duì)菌株進(jìn)行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，采用不同的誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度，確定最佳表達(dá)條件。對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，使用PIERCE公司的BCATM Protein Assay Kit試劑盒測(cè)定蛋白濃度。對(duì)目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，觀察目的蛋白的純度和分子量大小；對(duì)

6、目的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，一抗使用小鼠抗His抗體，二抗使用馬抗小鼠-AP抗體，顯色底物為NBT/BCIP。Neurocan蛋白免疫兔制備免疫血清，分4次免疫，皮內(nèi)注射。Elisa法檢測(cè)抗血清效價(jià)，以Neurocan蛋白包被酶標(biāo)板，兔免疫前血清為陰性對(duì)照，二抗為山羊抗兔-HRP，底物顯色后酶標(biāo)儀檢測(cè)；Western blot檢測(cè)抗血清特異性，以免疫血清為一抗，山羊抗兔-AP為二抗，NBT/BCIP顯色。 結(jié)果：

7、 合成的Neurocan基因經(jīng)測(cè)序鑒定，顯示序列正確，且開(kāi)放讀碼框正確。Neurocan基因經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)后，測(cè)得蛋白濃度為0.673ug/ul。目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定，目的條帶分子量大小約為55kD；經(jīng)Western blot鑒定，在55kD處有特異性條帶，與SDS-PAGE鑒定結(jié)果一致，目的蛋白能與His抗體特異性結(jié)合。制備的抗血清經(jīng)Elisa法檢測(cè)，效價(jià)達(dá)到1：100萬(wàn)；經(jīng)Western blot檢測(cè)，在55

8、kD處的目的條帶明顯。 討論： 本研究中，首先對(duì)合成的Neurocan基因進(jìn)行了測(cè)序鑒定，顯示其序列正確，且開(kāi)放讀碼框和酶切位點(diǎn)與本課題設(shè)計(jì)的一致。接著將包含Neurocan基因的質(zhì)粒PET30a（+）-Neurocan轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，進(jìn)行Neurocan蛋白的原核表達(dá)，對(duì)表達(dá)出的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，其分子量大小與通過(guò)堿基數(shù)計(jì)算出來(lái)的大小一致。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行Western blot鑒定，因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)在Ne

9、urocan基因的起始端設(shè)計(jì)了His標(biāo)簽，故一抗用His抗體，結(jié)果顯示目的蛋白能與His抗體特異性結(jié)合，說(shuō)明該目的蛋白是Neurocan基因的表達(dá)產(chǎn)物，而Neurocan基因經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定正確，提示Neurocan蛋白的原核表達(dá)成功。用此蛋白免疫兔制備的抗血清，經(jīng)Elisa檢測(cè)，效價(jià)達(dá)到1：100萬(wàn)；進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)，都證明特異性良好，所制備的多克隆抗體能與Neurocan蛋白特異性結(jié)合。因此提示，Neurocan蛋白