表柔比星殼聚糖隱形納米粒的制備及其抗腫瘤活性的檢測(cè).pdf

1、背景： 惡性腫瘤是對(duì)人類(lèi)身體健康危害最嚴(yán)重的疾病之一。在2007年召開(kāi)的第18屆國(guó)際抗癌聯(lián)盟大會(huì)上，世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項(xiàng)研究報(bào)告表明，全球癌癥狀況將日益嚴(yán)重，今后20年新患者人數(shù)將由目前的每年1000萬(wàn)增加到1500萬(wàn)，因癌癥而死亡的人數(shù)也將由每年600萬(wàn)增至1000萬(wàn)。在腫瘤治療中，化學(xué)治療是當(dāng)今臨床治療腫瘤的重要手段之一，但由于目前大部分化療藥物對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞缺乏選擇性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)往往也會(huì)損傷人體的正常細(xì)胞

2、。從而引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)及化療反應(yīng)率低，限制了其臨床應(yīng)用。因此提高藥物的靶向性是提高化療效果、降低藥物的毒副反應(yīng)的有效手段之一。 所謂納米（nm）即毫微米（millimic），1nm=10-9m（即十億分之一米），它所涉及的物質(zhì)層次處于既非宏觀又非微觀的相對(duì)獨(dú)立的中間領(lǐng)域——介觀（mesoscopy）。當(dāng)粒子尺寸進(jìn)入納米量級(jí)時(shí)，即具有量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，因而表現(xiàn)出若干新的不同于宏觀物質(zhì)的特性，諸

3、如低熔點(diǎn)、高比熱容、高膨脹系數(shù)、高反應(yīng)活性、高擴(kuò)散率、高強(qiáng)度、高韌性、奇特磁性以及極強(qiáng)的吸波性。納米技術(shù)是一門(mén)嶄新的技術(shù)，被國(guó)際上公認(rèn)為21世紀(jì)最有前途的科學(xué)領(lǐng)域，近年來(lái)，納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的運(yùn)用研究方興未艾。在對(duì)疾病的影像學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷、生物傳感器診斷以及生物芯片診斷等方面誕生一些新的方法，使患者得到更為及時(shí)和準(zhǔn)確的診斷。在治療方面，研究發(fā)現(xiàn)，利用納米級(jí)聚合物粒子作為新的藥物傳遞和控釋的載體，由于其超微小體積，可通過(guò)靶向定位及緩釋

4、作用進(jìn)入人體的細(xì)胞內(nèi)，對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等生命物質(zhì)進(jìn)行分子水平的治療，不但提高了現(xiàn)有藥物的療效，同時(shí)也大大減少了其本身的不良反應(yīng)。納米藥物的靶向作用根據(jù)其機(jī)制不同可分為三類(lèi)：①主動(dòng)靶向，將抗體或配體等特異性的靶向分子偶聯(lián)至粒子表面而使藥物定向分布到靶組織；②被動(dòng)靶向，對(duì)載體的理化性質(zhì)（大小、形狀、親水性、表面電荷和囊壁孔徑等）進(jìn)行控制和修飾可調(diào)控其在體內(nèi)的分布和藥物釋放特性，或選用對(duì)機(jī)體各種組織和病變親和力不同的納米粒也可達(dá)到靶向的目的；③

5、物理化學(xué)靶向，例如：利用體外局部磁場(chǎng)，以超順磁性納米粒為載體，在外加磁場(chǎng)作用下定向分布于預(yù)定的靶組織。通過(guò)改變納米顆粒的體積、質(zhì)量、電荷及親疏水性等理化性質(zhì)，可以減少抗腫瘤藥物與非靶向器官、組織及細(xì)胞的非特異性相互作用，從而增加靶部位/非靶部位的藥物比率，提高了抗腫瘤藥物療效的同時(shí)，降低了藥物的毒副反應(yīng)。因而納米控釋體系在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是在腫瘤的治療方面得到了廣泛的研究。例如用脂質(zhì)體（liposome）包裹阿霉素（商品名：楷萊），已經(jīng)在

6、臨床上得到了應(yīng)用，但脂質(zhì)體本身有一定的毒性，且包封率低、穩(wěn)定性差，因此，尋找更佳的載體材料是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 殼聚糖（Chitosan，CS）是一種廣泛存在于自然界的聚陽(yáng)離子多糖衍生物，又稱(chēng)可溶性甲殼質(zhì)、甲殼胺、幾丁聚糖等，由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖組成，是以β-（1，4）糖苷鍵連接起來(lái)的直鏈多糖，化學(xué)名為（1，4）-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖，其結(jié)構(gòu)類(lèi)似于纖維素。殼聚糖無(wú)毒，具有良好的生物相容性和可

7、降解性，由于其帶正電性，使其在液態(tài)介質(zhì)中可與帶負(fù)電荷的聚合物、大分子甚至一些聚陰離子相互作用，由此發(fā)生的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變過(guò)程則可方便地用于載藥納米微粒的制備；從生物藥劑角度來(lái)看，殼聚糖納米微粒具有附著在生物體黏膜表面的特性，這使得它尤其適用于黏膜藥物的靶向輸送。利用殼聚糖制備化療藥物、胰島素、抗生素等藥物的緩釋、控釋制劑及血脂吸附微球已取得較好的效果，部分已應(yīng)用于臨床，但在實(shí)際應(yīng)用中卻發(fā)現(xiàn)，普通載藥納米粒在血管中容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES

8、）迅速攝取并清除而難以達(dá)到預(yù)期效果，如果在普通納米粒表面通過(guò)物理吸附或共價(jià)結(jié)合一層或多層親水性聚合物，如聚乙二醇（PEG），則可形成蘑菇狀、毛刷狀或烙餅狀位阻層，從而阻止血漿蛋白調(diào)理素接近殼聚糖，降低血漿蛋白與殼聚糖之間的范德華引力，使殼聚糖納米?？商颖荏w內(nèi)單核細(xì)胞吞噬系統(tǒng)的捕獲，延長(zhǎng)納米粒及其攜帶藥物的血液循環(huán)時(shí)間，故稱(chēng)為“隱形”納米粒（stealth nanoparticles），克服了傳統(tǒng)納米粒在體內(nèi)大部分迅速被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RE

9、S）所吞噬，難于到達(dá)其他腫瘤組織的缺點(diǎn)，從而延長(zhǎng)在體內(nèi)循環(huán)的時(shí)間，通過(guò)腫瘤靶向治療機(jī)制——增強(qiáng)的滲透性和保留效應(yīng)，完成對(duì)腫瘤組織的靶向作用。 本研究我們選用CS作為原材料，采用陰離子凝聚法制備出包裹有抗癌藥物的載藥納米粒，并用聚乙二醇修飾，檢測(cè)其表征，通過(guò)體外細(xì)胞毒試驗(yàn)和體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)，探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 目的： 1．探討殼聚糖隱形納米粒作為抗癌藥物給藥系統(tǒng)的可行性。

10、 2．制備普通殼聚糖納米粒（CS NPs）和經(jīng)聚乙二醇修飾的隱形殼聚糖納米粒（PEG/CS NPs），并分別負(fù)載模型藥物表柔比星（EPI），檢測(cè)載藥納米粒的表征和體外釋藥性能。 3．觀察載藥納米粒在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，證明殼聚糖載藥納米粒與游離藥物同樣具有抗腫瘤效應(yīng)，進(jìn)一步證明殼聚糖納米粒能夠給對(duì)藥物起到緩釋作用。 4．對(duì)移植瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)，證明載表柔比星的殼聚糖隱形納米粒較普通納米粒具有更好的體內(nèi)抑

11、瘤作用，更適合作為化療藥物的載體。 方法： 1．利用PEG上帶負(fù)電的氧基與殼聚糖上帶正電的氨基通過(guò)分子間氫鍵結(jié)合，再應(yīng)用陰離子凝聚法制備經(jīng)PEG修飾的載藥納米粒，透射電鏡觀察納米粒的形態(tài)特征，激光粒度分析儀測(cè)定粒徑大小及分布，紫外分光光度法測(cè)定納米粒的載藥量，動(dòng)態(tài)透析法考察載藥納米粒的體外釋放特性。 2．體外培養(yǎng)5-8F鼻咽癌細(xì)胞，通過(guò)MTT法測(cè)定和研究不同濃度的載藥納米粒、空白納米粒和游離藥物與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)4

12、、48、72h后對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率，并推算當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)的所需藥物濃度，即IC50值。 3．制備S-180實(shí)體移植瘤小鼠，采用尾靜脈注射方法給藥，設(shè)隱形載藥納米粒、普通載藥納米粒、游離藥物和生理鹽水四組，給藥后一周處死小鼠，剝離瘤體、稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率。 4．采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，體外細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析；體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)采用選用one-w

13、ay ANOVA，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)后，采用Dunnett's法進(jìn)行多重比較，以P<0．05表示差異具有顯著性。 結(jié)果： 1．按CS/TPP質(zhì)量比為6：1，CS/EPI質(zhì)量比為8：1時(shí)，制備的載藥納米粒呈圓形或橢圓形，分散性良好，平均粒徑322nm，載藥量為13．9±1．1%，包封率74．2±1．8%，72小時(shí)累積釋藥率達(dá)82%。 2．載藥殼聚糖納米粒在體外對(duì)5-8F鼻咽癌細(xì)胞株的增殖抑制作用具有濃度和時(shí)

14、間依賴(lài)性，隨藥物濃度的增大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸提高，而空白納米粒僅在高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用。 3．載表柔比星的隱形殼聚糖納米粒組、載表柔比星的普通殼聚糖納米粒組和游離表柔比星組抑瘤率均顯著高于生理鹽水對(duì)照組（P<0．05）；與游離藥物組比較，殼聚糖納米粒包封提高了藥物的抗腫瘤作用（P<0．01），與普通殼聚糖納米粒組相比，隱形殼聚糖納米粒組的抑瘤作用更強(qiáng)（P=0．023）。 結(jié)論： 1．采用陰