神經元限制性沉默因子參與大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞體外分化過程的實驗研究.pdf

1、[目的]：
　　 1、研究成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯合全反式維甲酸誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經樣細胞體外分化過程中的神經特異性標志的表達變化。
　　 2、分析神經元限制性沉默因子(NRSF/REST)以及NRSF調控的基因在成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯合全反式維甲酸誘導大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)向神經元分化過程中表達的變化。
　　 3、探討神經元限制性沉默因子(NRSF/

2、REST)在大鼠MSCs向神經元分化的作用及MSCs向神經元分化的進程。
　　 [方法]
　　 1.通過貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質干細胞，并經形態(tài)學、細胞表面標記和分化潛能鑒定。
　　 2.取P5代細胞種植于6孔板。用10ng/ml bFGF預誘導24小時后，采用成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯合全反式維甲酸的方案進行誘導，分別于干預前與干預后1，3，5，7，9天，采用免疫細胞熒光化學檢測神經元

3、特異性稀醇化酶NSE，神經微管蛋白β-tubulinⅢ及膠質細胞標志GFAP的陽性率及實時定量PCR染料法NSE、β-tubulinⅢ和GFAP的mRNA的表達水平。
　　 3.采用實時定量PCR染料法，對照組不加誘導劑，分別于干預前與干預后1，3，5，7，9天檢測神經元限制性沉默因子(NSRF/REST)及其相關基因β-TrCP、SCG10、BDNF的mRNA的相對表達量。
　　 [結果]
　　 1.通過貼壁法

4、分離培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質干細胞，5代后細胞呈均一梭形漩渦樣生長，流式細胞術檢測間充質干細胞表面抗原CD34-，CD45-，CD90+。具有向脂肪細胞，神經細胞分化的多向潛能。
　　 2.應用成纖維生長因子bFGF，堿性生長因子EGF聯合全反式維甲酸的誘導方案可以將MSCs誘導分化成神經元樣細胞，誘導后的細胞神經元標記物神經元特異性烯醇化酶NSE，神經微管蛋白β-tubulinⅢ及膠質細胞標志GFAP呈陽性。神經元特異性稀醇化酶

5、NSE.，神經微管蛋白β-tubulinⅢ的表達與時間呈趁勢正相關，第7天表達最高，誘導第9天表達下降；膠質細胞標志GFAP于誘導第9天表達明顯增加。
　　 3.神經元限制性沉默因子(NSRF/REST)于誘導第5天表達顯著下降，β-TrCP于誘導第5天表達增高，NRSF的靶基因SCG10、BDNF表達有不同程度的上調。
　　 [結論]
　　 1.貼壁法可以大量培養(yǎng)骨髓間充質干細胞。
　　 2.采用細胞因